XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemWUS2
利用非整合型Wus2载体增强玉米转化和定点诱变
摘要：高效的遗传转化是快速进行基因功能分析和作物性状改良的先决条件。我们最近证明，使用我们的快速农杆菌介导转化方法，具有 NptII /G418 选择和兼容辅助质粒的新型 T-DNA 双元载体可以有效地转化玉米自交系 B104。在这项工作中，我们实施了非整合型 Wuschel2 (Wus2) T-DNA 载体方法进行农杆菌介导的 B104 转化，并测试了其对难转化自交系 B73 转化和基因编辑的潜力。非整合型 Wus2 (NIW) T-DNA 载体辅助转化方法使用两株农杆菌菌株：一株携带目的基因 (GOI) 构建体，另一株提供 NIW 构建体。为了监测 Wus2 与玉米基因组的共整合，我们将由强组成型启动子驱动的玉米 Wus2 表达盒与新的可见标记 RUBY 相结合，后者产生紫色色素甜菜碱。作为 GOI 构建体，我们使用之前测试过的 CRISPR-Cas9 构建体 pKL2359 进行 Glossy2 基因诱变。当 GOI 和 NIW 构建体都由 LBA4404Thy 菌株递送时，B104 转化频率显著提高了约两倍（10% vs. 18.8%）。重要的是，我们能够使用 NIW 辅助转化方法转化顽固性自交系 B73，并通过省略选择剂 G418 获得了三株无转基因编辑植物。这些结果表明，NIW 辅助转化可以提高玉米 B104 转化频率，并为 CRISPR 技术用于无转基因基因组编辑提供一种新选择。
病毒介导的形态调节剂的递送使高粱双色（L.）
使用叶片组织作为外植物材料的单子蛋白转化的最新进展已扩大了能够转基因的草物种的数量。然而，矢量的复杂性和对基本形态调节剂的诱导切除率的依赖性迄今已有限的广泛应用。Plant RNA viruses, such as Foxtail Mosaic Virus (FoMV), present a unique opportunity to express morphogenic regulator genes, such as Babyboom ( Bbm ), Wuschel2 ( Wus2 ), Wuschel-like homeobox protein 2a ( Wox2a ), and the GROWTH- REGULATING FACTOR 4 (GRF4) GRF-INTERACTING FACTOR 1 (GIF1) fusion protein transiently在叶外植物组织中。此外，传统和病毒矢量的利他传递可以提供简化用于叶片转化的向量的机会 - 促进矢量优化并降低对形态学调节基因整合的依赖。在这项研究中，使用高粱双高粱叶叶植体促进胚胎calli的形成的能力，这是促进胚胎转化方案的关键步骤的能力。尽管传统的叶转换载体产生了可行的胚胎calli（43.2±2.9％：GRF4-GIF1，50.2±3％：BBM / WUS2），但采用GRF4-GIF1形态学调节剂的极端传统载体导致提高的效率，导致了改善的效率（61.3±4.7％）。无私的递送，分别为75.1±2.3％和79.2±2.5％的胚胎calli形成。由常规和病毒载体产生的胚胎calli产生了表达荧光记者的芽，并使用分子分析证实。这项工作为使用利他的载体和病毒表达的形态学调节剂提供了重要的概念证明，以改善植物转化。
玉米中有效的基因切除系统
使用形态学基因婴儿繁荣（BBM）和wuschel2（WUS2）以及新的三元构建体增加了基因型范围和可用于玉米转化的外植体的类型。进一步优化BBM / WUS2的表达模式已导致快速玉米转化方法，这些方法更快，适用于更广泛的近交范围。但是，BBM / WUS2的表达会损害再生植物的质量，从而导致不育。我们推论转化后的剪切形态基因，但在再生之前会增加肥沃的T0植物的产生。我们开发了一种使用诱导位点特异性重组酶（CRE）来消除形态学基因的方法。在早期胚胎发育中使用了受发展调控的启动子，例如OLE，GLB1，END2和LTP2，以驱动CRE的CRE切除，并以25-100％的速度产生切除的事件。利用切除激活的可选标记的一种不同的策略，以53 - 68％的速度产生了切除的事件；但是，转化频率较低（13-50％）。使用诱导热冲击启动子（例如hsp17.7，hsp26）表达CRE，以及组织培养条件和构造设计的改善，导致T0转化的高频（29-69％），切除（50 - 97％），可用的质量事件（4--15％）（4-15％），几乎没有Escapes（非TransgaInic; 14 - 17％; 14 - 17％; 14 - 17％;该方法产生的转基因事件不含形态学和标记基因。
高频WUS2集成转换工具包提高了CAS9的编辑效率，并通过高粱中的Spry扩展了能力
。cc-by 4.0国际许可（未经Peer Review尚未获得认证）是作者/资助者，他已授予Biorxiv的许可证，以永久显示预印本。这是该版本的版权持有人，该版本发布于2025年1月24日。 https://doi.org/10.1101/2025.01.21.634218 doi：Biorxiv Preprint
病毒介导的形态调节剂的递送使高粱双色（L.）
使用叶片组织作为外植物材料的单子蛋白转化的最新进展已扩大了能够转基因的草物种的数量。然而，矢量的复杂性和对基本形态调节剂的诱导切除率的依赖性迄今已有限的广泛应用。Plant RNA viruses, such as Foxtail Mosaic Virus (FoMV), present a unique opportunity to express morphogenic regulator genes, such as Babyboom ( Bbm ), Wuschel2 ( Wus2 ), Wuschel-like homeobox protein 2a ( Wox2a ), and the GROWTH- REGULATING FACTOR 4 (GRF4) GRF-INTERACTING FACTOR 1 (GIF1) fusion protein transiently在叶外植物组织中。此外，传统和病毒矢量的利他传递可以提供简化用于叶片转化的向量的机会 - 促进矢量优化并降低对形态学调节基因整合的依赖。在这项研究中，使用高粱双高粱叶叶植体促进胚胎calli的形成的能力，这是促进胚胎转化方案的关键步骤的能力。尽管传统的叶转换载体产生了可行的胚胎calli（43.2±2.9％：GRF4-GIF1，50.2±3％：BBM / WUS2），但采用GRF4-GIF1形态学调节剂的极端传统载体导致提高的效率，导致了改善的效率（61.3±4.7％）。无私的递送，分别为75.1±2.3％和79.2±2.5％的胚胎calli形成。由常规和病毒载体产生的胚胎calli产生了表达荧光记者的芽，并使用分子分析证实。这项工作为使用利他的载体和病毒表达的形态学调节剂提供了重要的概念证明，以改善植物转化。
植物基因编辑不再需要组织培养
植物基因编辑可对植物进行有针对性的改造，在作物的基因功能分析和精准育种方面显示出巨大的潜力[1]。要生产基因编辑植物，需要将基因编辑试剂[2]（例如 CRISPR/Cas9 成分）递送到植物细胞中。这涉及一个漫长、昂贵且劳动密集型的组织培养步骤，而且目前仅在有限数量的植物物种中可行，这成为植物基因编辑的主要瓶颈。在最近一期的《自然生物技术》上，由 Daniel F. Voytas 领导的明尼苏达大学研究小组描述了一种生产基因编辑植物的新方法，同时避免了组织培养的需要（图 1）[3]。该方法利用了分生组织的从头诱导。分化的植物细胞通常不能分裂或产生不同类型的细胞。然而，之前的研究表明，通过异位表达特定的发育调节因子，可以诱导已经分化的细胞形成分生组织。分生组织是包含未分化干细胞（分生细胞）的植物组织，这些干细胞能够进行细胞分裂，并能产生各种组织和器官。例如，在拟南芥中，WUSCHEL ( WUS ) 基因在胚胎发生中起着关键作用，过表达 WUS 可以促进营养生长向胚胎生长的转变 [ 4 ] 。SHOOT MERISTEMLESS ( STM ) 和 WUS 的联合异位表达可激活拟南芥中的一组分生组织功能，包括细胞分裂和器官发生 [ 5 ] 。 ipt 基因位于土壤细菌农杆菌的 Ti 质粒上，该基因编码异戊烯基转移酶，这种酶在植物中诱导细胞分裂素的生物合成，从而刺激器官发生[6]。在单子叶植物中，婴儿潮基因（Bbm）和 WUS 基因的过度表达可促进体细胞形成胚胎，从而提高转化效率[7]。Voytas 研究小组假设分生组织可以在发育调节因子的帮助下诱导。为了验证这一想法，使用多种启动子以不同的组合在本氏烟植物中表达了玉米 WUS2、拟南芥 STM、农杆菌 ipt 和其他发育调节因子。农杆菌用于传递转基因，并以荧光素酶作为报告基因。形成了分生组织状结构，这些结构长成具有荧光素酶表达的转基因植物，并且发现该特性是可遗传的。然后，使用相同的方法，将针对两个测试基因的单个向导 RNA (sgRNA) 与成功组合的发育调节剂一起引入组成性表达 Cas9 的转基因本氏烟叶中。在产生的芽中，可以验证目标基因的编辑，并且发现突变会传递给下一代。随后出现了一个问题，即在土壤中生长的植物上是否也能诱导分生组织。这种方法确实在许多双子叶植物中被证明是成功的，除了本氏烟草，在马铃薯和葡萄中也是如此。此外，还产生了基因编辑的本氏烟草植物，并且发现一些编辑过的植物不含有用于编辑的转基因。从头分生组织诱导方法被称为 Fast-TrACC（快速处理的农杆菌共培养），与传统的组织培养程序相比具有明显的优势（图 1）。首先，它大大缩短了生产基因编辑植物所需的时间，从几个月缩短到几周。其次，Fast-TrACC 不需要无菌条件，并且适用于在土壤中生长的植物。组织培养方法要求使用无菌工作台和无菌培养基，因此无组织培养方法需要的资源更少，并且适用于较小的群体。第三，当 Cas9 与 sgRNA 一起递送时，在某些情况下会产生基因编辑植物