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重新审视 CRISPR/Cas 介导的作物改良
基因组编辑 (GE) 技术已成为一种多方面的策略，它瞬间普及了改变生物体遗传构成的机制。基于成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的基因组编辑 (CRISPR/Cas) 方法具有巨大潜力，可以有效编辑多种生物体的基因组。与巨核酸酶、锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 相比，该框架因其灵活性、多功能性和效力而更经济。序列特异性核酸酶 (SSN) 的出现允许在基因组中精确诱导双链断裂 (DSB)，从而确保通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径实现所需的改变。研究人员已利用 CRISPR/Cas 介导的基因组改造对作物品种进行改造，以产生提高产量、丰富营养品质和抗逆性的理想特性。本文重点介绍了通过基于 CRISPR/Cas 的工具进行基础植物研究和作物遗传改良，在作物营养改良领域取得的最新进展。这种基因组编辑的应用有助于揭示植物的基本生物学事实，并辅以全基因组关联研究、人工智能和各种生物信息学框架，从而提供未来的模型研究及其确认。本文回顾了通过这种现代生物技术方法开发的减少“脱靶”效应和社会对基因组改造作物认可的策略。
使用基因编辑方法微调免疫系统
基因组编辑技术不仅提供了研究基本细胞系统功能的前所未有的机会，而且还可以改善几种临床应用的结果。在这篇综述中，我们分析了从基础研究和临床角度来调查免疫系统的各种基因编辑技术。我们讨论了可编程核酸酶开发的最新进展，例如锌 - 纤维核酸酶（ZFN），转录激活剂样效应核酸酶（TALEN）和定期间隔的短距离短palindromic重复（CRISPR） - cas-cas相关核酶。我们还讨论了可编程核酸酶及其衍生试剂的使用，例如通过基因破坏，插入和重写T细胞和其他免疫成分的基础编辑工具来设计免疫细胞，例如天然杀手（NKS）和造血干细胞和祖细胞（HSPCS）。此外，关于嵌合抗原受体（CAR），我们描述了不同的基因编辑工具如何使健康的供体细胞可用于CAR T疗法，而不是自体细胞，而无需危害移植物抗旋转疾病或拒绝，从而导致收养细胞治疗成本降低，并立即治疗患者。我们特别注意将治疗性转基因（例如汽车）的递送到内源性基因座，以防止附带损害并提高治疗有效性。最后，我们审查了包括免疫系统重新利用在内的创新创新，这些创新促进了临床癌症免疫疗法框架内的安全和有效的基因组手术。
昆虫基因组编辑：CRISPR 技术及其前景
摘要 ：昆虫是最大的动物群之一，由于其多样性、在农业和家庭手工业中的经济意义以及作为传粉者和各种疾病媒介的生态功能而发挥着至关重要的作用。遗传学的重大进步为许多昆虫物种的基因身份和序列提供了大量信息。这些遗传资源促进了旨在开发改良遗传性状的基因组编辑研究。昆虫不育技术（SIT）就是这样一种策略，它已有效地用于北美的螺旋蝇，并继续用于管理昆虫害虫。通过 RNA 干扰（RNAi）进行的基因沉默是模型昆虫研究中的基本基因组工具，也已应用于各种生物学研究。然而，它在害虫中的效率各不相同，限制了它的广泛使用。其他基因编辑方法包括使用锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 诱导 DNA 中的双链断裂 (DSB)，从而刺激目标序列的非同源末端连接或同源定向修复。最近，CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9）系统已迅速成为跨多个领域的变革性基因组编辑方法，包括农业、昆虫抗性管理、环境安全、人类健康和工业。本文概述了昆虫中使用的各种基因组编辑技术，特别关注尖端 CRISPR/Cas 系统的应用和未来潜力，该系统有望超越其他基因组编辑方法。
使用息肉素反向Hoogsteen发夹技术对点突变的基因校正
单基因疾病通常是特定基因单点突变的结果，导致非功能蛋白的产生。不同的血液疾病，例如β-丘脑贫血，镰状细胞病，遗传性球细胞增多症，fanconi贫血和血友病A和B，通常是由点突变引起的。基因编辑工具，包括Talens，ZFN或CRISPR/CAS平台，以纠正负责不同疾病的突变。然而，不依赖核酸酶活性的替代分子工具，例如形成三核苷酸及其衍生物（例如肽核酸），也证明了它们在DNA中纠正突变的能力。在这里，我们回顾了修复 - 螺肽反向Hoogsteen发夹（PPRHS）技术，该发夹可以代表该领域内的替代基因编辑工具。修复-PPRHS是由由五甲状腺素桥连接的两个息肉素镜重复序列形成的单链DNA分子，然后在分子的一端进行扩展序列，该序列是与DNA序列同源的，但要修复了DNA序列，但含有修复的DNA序列。PPRH的两个息肉臂由嘌呤之间的分子内反间隔键结合，从而形成了发夹结构。该发夹芯与watson-crick键以序列特异性方式与dsDNA中靶突变相对近乎近距离突变结合，从而产生了刺激重组的三重结构。这项技术已成功地用于修复其内源性基因座中DHFR和APRT基因突变体在哺乳动物细胞中的集合，并且可以适合校正负责血液疾病的突变。
基于基因编辑技术的非人灵长类动物模型构建
[3] Cho J, Parks ME, Dervan PB. Cyclic polyamides for identification in the minor groove. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 10389-92 [4] Shen B, Zhang J, Wu H, et al. Generation of gene- modified mice via Cas9/RNA-mediated gene hunting. Cell Res, 2013, 23: 720-3 [5] Mali P, Esvelt KM, Church GM. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods, 2013, 10: 957-63 [6] Wang H, Yang H, Shivalila CS, et al. One-stepgeneration of mice carrymutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated gene engineering. Cell, 2013, 153: 910-8 [7] Wood AJ, Lo TW, Zeitler B, et al.使用ZFN和TALEN进行跨物种靶向基因组编辑。科学，2011，333：307 [8] Moscou MJ、Bogdanove AJ。TAL效应子通过一种简单的密码控制DNA识别。科学，2009，326：1501 [9] Lo TW、Pickle CS、Lin S等人。使用TALEN和CRISPR/Cas9对进化多样化的线虫进行精确且可遗传的基因组编辑以设计插入和缺失。遗传学，2013，195：331-48 [10] Cho SW、Kim S、Kim JM等人。利用Cas9 RNA引导的核酸内切酶在人类细胞中进行靶向基因组工程。自然生物技术，2013，31：230-2 [11] Gaj T、Gersbach CA、Barbas CF第3。基于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas的基因组工程方法。Trends Biotechnol，2013，31：397-405 [12] Brandsma I, Gent DC. DNA双链断裂修复中的途径选择：平衡行为的观察。
利用 CRISPR/Cas9 技术生成和鉴定转基因人类多能干细胞的流程
由于其无限的增殖潜力、整倍体状态以及向任何细胞类型分化的能力，人类多能干细胞 (hPSC)（无论是胚胎细胞还是诱导细胞）在疾病建模和生产临床应用细胞方面具有巨大潜力 [ 1 – 3 ]。尽管已经建立了来自患有各种疾病的患者的许多 hPSC 系，但是针对某些病理或罕见基因突变生成 hPSC 系仍然具有挑战性。此外，个体间的遗传异质性可能导致生物学变异，从而使系间比较困难，尤其是来自健康对照和患者的 hPSC 之间的比较 [ 4 , 5 ]。对 hPSC 进行遗传操作的能力为我们引入、修改或校正突变以及生成遗传匹配的同基因对照系提供了机会，从而建立明确的基因型-表型关联 [ 6 , 7 ]。近年来，基于位点特异性核酸酶（包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)，尤其是成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 系统）的技术已使 hPSC 的基因组工程变得十分灵活 [8,9]。然而，由于 hPSC 的固有特性，包括相对较差的转染效率和转染后存活率低、难以分离克隆群、优先选择和扩增非整倍体克隆以及自发细胞分化，hPSC 工程仍然具有挑战性。为了缓解这些问题，已经描述了几种用于产生各种不同诱变事件的方案 [10-14]。尽管人们投入了大量精力来改进产生转基因 hPSC 的方法程序，但只有少数研究
儿童软组织肉瘤的 CRISP(Y) 未来
从 Jinek 等人（2012、2013）和 Qi 等人（2013）的工作开始，原核生物用于防御外源病毒的自适应系统——成簇的规律间隔回文重复序列 (CRISPR) 与 CRISPR 相关核酸内切酶 9 (Cas9) 配对，越来越多地被认可为一种强大而有效的基因组编辑工具。RNA 引导的 CRISPR/Cas9 由一条小的引导 RNA (sgRNA) 与 Cas9 复合而成，它与目标 DNA 配对会诱导单个 Cas9 依赖的双链断裂 (DSB)（由 Lino 等人，2018 年综述）。由此产生的编辑包括在活细胞基因组的特定目标区域删除或插入特定序列，或改变预先存在的 DNA 序列（图 1）。近期，该技术已得到丰富，可用于标记 DNA 区域（Banito 等人，2018 年）、调节内源基因表达（La Russa 和 Qi，2015 年）或改变表观遗传状态（Vojta 等人，2016 年）。与转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和锌指核酸酶 (ZFN) 技术相比，CRISPR/Cas9 允许进行多重分析，构建速度快且更易于递送，编辑效率更高，即使脱靶切割更频繁（Gupta 和 Musunuru，2014 年）。在过去十年中，这种方法已经进入了癌细胞存活、转移和耐药性的基础和临床前肿瘤学研究领域。在这篇小型评论中，我们将概述 CRISPR/Cas9 技术，特别关注其在揭示致瘤机制和确定一组易位阳性儿童软组织肉瘤 (STS) 中可能针对的途径中的应用。
锌指蛋白靶向霍乱毒素A（ctxA）基因...
摘要 背景与目的：本研究利用锌指核酸酶（ZFN）技术破坏霍乱毒素基因（ctxA），抑制霍乱弧菌（V. cholera）产生CT毒素。实验方法：设计一个工程化的ZFN，靶向ctxA基因的催化位点，将ZFN编码序列克隆到pKD46、pTZ57R T/A载体和E2-crimson质粒中，转化大肠杆菌（E. coli）Top10和霍乱弧菌，通过菌落计数法评估ZFN的转化效果。结果：转化后的大肠杆菌经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹实验未见表达，ctxA基因测序未见突变，pKD46-ZFN质粒聚合酶链式反应结果为阴性。用含有完整 ZFN 序列的 T/A 载体转化大肠杆菌 Top10 产生 7 个菌落，所有菌落均含有具有自连接载体的细菌。用左阵列 ZFN 转化产生 24 个菌落，其中 6 个含有具有自连接载体的细菌，18 个含有具有载体/左阵列的细菌。用含有完整 ZFN 的 E2-深红色载体转化霍乱弧菌未产生任何菌落。用左阵列载体转化产生 17 个含有具有载体/左阵列的细菌的菌落。使用蛋白质印迹分析捕获左阵列蛋白带。结论和意义：由于缺乏非同源末端连接 (NHEJ) 机制，ZFN 可能脱靶细菌基因组，从而导致致命的双链 DNA 断裂。建议开发针对细菌基因的 ZFN，具有 NHEJ 修复系统的工程包装宿主是必不可少的。关键词：ctxA 基因；基因编辑工具；霍乱弧菌；锌指核酸酶。
IE 型 CRISPR-Cas 系统作为酿酒酵母的防御系统
病毒和其他移动遗传元件 (MGE) 对大多数已研究的细胞生物体而言都是潜在威胁，它们充当捕食者或降低适应性。作为应对，生物体进化出了多种防御策略，主要分为先天系统和适应性系统。先天系统的特点是被某些预设的感染特征激活。另一方面，适应性系统可以学会检测以前未被识别的病原体。长期以来，脊椎动物的适应性免疫系统是唯一已知的适应性系统的例子，但已证明古菌和细菌的成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas 系统是真正的适应性免疫系统 (1)。所有已研究的 CRISPR-Cas 系统都基于短 DNA 或 RNA 序列（原间隔区），例如来自病毒基因组的序列，这些序列作为 DNA 间隔区存储在 CRISPR 基因座中。长前体 CRISPR 转录本 (pre-crRNA) 被加工成 CRISPR RNA (crRNA)，并被 Cas 蛋白效应子用来定位和摧毁匹配的靶标。根据 CRISPR-Cas 系统的类型，靶标可以是 DNA 或 RNA。CRISPR-Cas 系统种类繁多，目前分为两类。第 1 类包括 I、III 和 IV 型系统，第 2 类包括 II、V 和 VI 型系统。每种系统类型又包括几种亚型 (2, 3)。可编程核酸酶，如锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 Cas9，可通过诱导致残突变在真核细胞中充当抗 MGE 系统。特别是，Cas9 彻底改变了真核生物的基因编辑，已被证明可以有效靶向多种人类病毒 (4)。在基本的 Cas9 技术中，DNA 切割由单一引导
开发模块化双生病毒载体以实现植物的高表达和基因靶向
* 通讯地址：电话：919-515-5729；电子邮件：jmalonso@ncsu.edu 摘要 病毒载体可以成为表达重组蛋白以及递送基因编辑机制的有用工具。尽管它们很有用，但这些工具的开发和后续优化通常是一个困难而繁琐的过程。因此，尽管已经做了大量工作来创建用于基因编辑和蛋白质表达的有用病毒载体，但对于如何最好地设计这些载体以用于特定应用，人们缺乏了解。例如，通常不清楚加入异源启动子序列或不同的病毒成分是否会改善货物表达或复制子积累。为了解决其中一些障碍，我们设计了一种基于双生病毒 - 甜菜卷叶病毒 (BCTV) 的 GoldenBraid (GB) 兼容病毒载体系统。该系统允许对各种报告构建体进行简单的模块化克隆。利用这种模块化克隆策略，我们比较了各种替代病毒载体架构。有趣的是，天然 BCTV 启动子的表现优于组成型 35S 启动子，而 BCTV 病毒体正义基因的去除则促进了报告基因的表达。有趣的是，这些修改对总复制子积累没有影响。这些结果表明了新的模块化基于 BCTV 的病毒载体在蛋白质表达和基因靶向应用方面的实用性，同时也揭示了可能为未来基于双生病毒的病毒载体架构提供信息的设计原则。我们预计，这种新模块化系统的推出将引发基于复制子的策略在植物蛋白质表达和基因编辑实验中的广泛应用。关键词：病毒载体、基因编辑、甜菜曲顶病毒、双生病毒、GoldenBraid、瞬时表达。简介病毒载体已被证明可用于各种生物技术应用，例如基因组编辑和蛋白质表达。基于双生病毒的病毒载体已用于递送基因组编辑酶，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 Cas9，以及用于同源定向修复 (HDR) 的修复模板 (RT) (Butler 等人，2016 年；Wang 等人，2017 年；Yu 等人，2020 年；Gil-Humanes 等人，2017 年；Dahan-Meir 等人，2018 年，Eini 等人，2022 年)。