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稳定表达 Cas9 和 T7 RNA 聚合酶的利什曼原虫 (Viannia) braziliensis 的有效基因组编辑
直到 2015 年，阐明利什曼原虫蛋白质功能的功能丧失研究都依赖于通过同源重组进行基因破坏。随后，CRISPR/Cas9 革命影响到了这些原生动物寄生虫，只需一轮转染即可实现有效的基因组编辑。此外，LeishGEdit 的开发（一种基于 PCR 的工具包，用于使用 CRISPR/Cas9 生成敲除和标记系）使基因组编辑更加直接有效。在此系统中，质粒 pTB007 被递送至利什曼原虫，在 b-微管蛋白基因座中进行游离表达或整合，并稳定表达 T7 RNA 聚合酶和 Cas9。在南美洲，尤其是在巴西，利什曼原虫 (Viannia) braziliensis 是皮肤利什曼病最常见的病原体。与利什曼原虫相比，L. braziliensis b-微管蛋白基因座表现出显著的序列差异，这阻碍了 pTB007 的有效整合和 Cas9 的稳定表达。为了克服这一限制，pTB007 中存在的 L. major b-微管蛋白序列被利什曼原虫 (Viannia) b-微管蛋白保守序列取代，从而产生了 pTB007_Viannia 质粒。这一修改使 pTB007_Viannia 盒式磁带成功整合到 L. braziliensis M2903 基因组中，并且计算机预测表明这也可以在其他 Viannia 物种中实现。通过敲除鞭毛蛋白 PF16 来评估 Cas9 的活性，这导致这些转染子中出现不动表型。内源性PF16也成功被mNeonGreen标记，并采用基因座互补策略将PF16基因的C端标记拷贝返回到原始基因座，从而恢复游泳能力。
可编程的无所不能的Argonaute核酸酶来自中介细菌Kurthia massiliensis
Argonaute（AGO）蛋白是生命所有领域中存在的保守核酸引导的蛋白质。真核生物Argonaute蛋白（EAGOS）是RNA干扰途径中的关键玩具，并且在生理温度下起RNA引导的RNA核酸内切酶的作用。尽管Eagos被认为是从原核蛋白质（Pagos）演变而来的，但先前研究的Pagos无法在生理温度下催化RNA引导的RNA裂解。在这里，我们描述了来自中粒细菌库尔西亚马西里尼斯（Kmago）的独特pago。kmago利用DNA指南裂解具有较高活性的单链DNA（ssDNA）和RNA靶标。kmago还利用RNA指南在适度的温度下裂解ssDNA和RNA靶标。我们表明，Kmago可以使用5'磷酸化的DNA指南，以切割SS-DNA和RNA，例如Butyricum of Of。小的DNA结合赋予了Kmago上的显着热稳定性，我们可以通过避免DNA指南加载温度来抑制空kmago的独立于导向的质粒加工活性。更重要的是，Kmago在37°C上执行双链DNA和高度结构化的RNA的可编程切割。因此，Kmago可以被视为一种DNA引导的可编程无内能力核酸酶，以使大多数类型的核酸有效地切断。这项研究扩大了我们对AGO蛋白质的理解，可以扩展基于Pago的DNA和RNA MA-MA-MA-MA-MA-MA-NIPULATION工具箱。
谁需要社会安全号码和个人纳税人识别号？为了合法工作并提交联邦纳税申报表，您、您的配偶以及您打算申请免税的任何受抚养人都必须拥有有效的社会安全号码 (SSN) 或个人纳税人识别号 (ITIN)。虽然所有军人通常都有 SSN，但如果军人最近由于结婚、离婚或任何其他法律原因而更改了其法定姓名，则必须立即通知社会保障管理局其姓名更改，方法是填写社会保障管理局社会保障卡申请表 SS-5 ( http://www.ssa.gov/online/ss-5.pdf ) 或 SS-5-FS ( http://www.ssa.gov/online/ss-5fs.pdf )。注意：只有当您居住在美国境外或代表居住在美国境外的孩子申请号码或卡时，才使用表格 (SS-5-FS)。此外，美国公民、美国公民所生的新生儿、持有美国绿卡的外国人以及获得美国移民归化局许可在美国工作的外籍居民都需要 SSN。属于上述任何类别但没有有效 SSN 的人也必须申请 SSN。纳税人识别号 (ITIN) 申请流程。如果您或您的任何家庭成员拥有或有资格获得美国社会安全号码 SSN，请不要申请 ITIN。ITIN 由美国国税局颁发，仅用于联邦税收目的。一旦您和/或社会保障局确定个人没有资格获得 SSN，他们必须使用美国国税局表格 W-7“申请美国国税局个人纳税人识别号”申请 ITIN。可以从 IRS 网站 @ http://www.irs.gov/pub/irs-pdf/fw7.pdf 下载并获取副本，其中包含所有说明。虽然在许多情况下，ITIN 申请是在提交联邦纳税申报表的同时提出的，但只要所有所需文件齐全，就可以随时完成。通常需要大约 4-6 周的时间才能完成该流程并获得 ITIN 分配。无论何时提出申请，该流程都涉及填写尽可能多的申请表，然后亲自将其带到位于萨利纳斯的 IRS 地区办事处（或任何其他 IRS 办事处），并附上说明中所述的所有所需文件的原件。然后，IRS 将协助您完成申请并将其邮寄出去进行处理。在前往 IRS 办事处之前，请仔细阅读申请表随附的说明，以确保您拥有所有所需文件。在纳税季节开始之前完成此过程并分配 ITIN 特别有益。通过在提交纳税申报表之前分配 ITIN，VITA 税务中心将能够以电子方式提交您的纳税申报表，您将在 7-10 天内收到应得的任何退税。如果在您提交联邦和州纳税申报表的同时申请 ITIN，您的纳税申报表和任何应得的退税将至少延迟 4-6 周，直到分配 ITIN。如果没有 SSN 或 ITIN，联邦和州纳税申报表都不能以电子方式提交，因此它们不是以电子方式提交的，这迫使您提交两者的硬拷贝。这种提交申报表的硬拷贝方法被称为“纸质提交”，比电子提交慢得多。如果在纳税季节申请 ITIN，ITIN 和纳税申报表的处理时间很有可能会超过 4-6 周。延迟的原因是因为纳税申报表被搁置，直到分配 ITIN 之后。然后，一旦分配了 ITIN 并将其添加到纳税申报表中，就会处理纳税申报表。美国国税局强烈鼓励每个人尽可能以电子方式提交纳税申报表，并已公开宣布只有在所有以电子方式提交的纳税申报表之后才会处理纸质纳税申报表。
谁需要社会安全号码和个人纳税人识别号？为了合法工作并提交联邦纳税申报表，您、您的配偶以及您打算申请免税的任何受抚养人都必须拥有有效的社会安全号码 (SSN) 或个人纳税人识别号 (ITIN)。虽然所有军人通常都有 SSN，但如果军人最近由于结婚、离婚或任何其他法律原因而更改了其法定姓名，则必须立即通知社会保障管理局其姓名更改，方法是填写社会保障管理局社会保障卡申请表 SS-5 ( http://www.ssa.gov/online/ss-5.pdf ) 或 SS-5-FS ( http://www.ssa.gov/online/ss-5fs.pdf )。注意：只有当您居住在美国境外或代表居住在美国境外的孩子申请号码或卡时，才使用表格 (SS-5-FS)。此外，美国公民、美国公民所生的新生儿、持有美国绿卡的外国人以及获得美国移民归化局许可在美国工作的外籍居民都需要 SSN。属于上述任何类别但没有有效 SSN 的人也必须申请 SSN。纳税人识别号 (ITIN) 申请流程。如果您或您的任何家庭成员拥有或有资格获得美国社会安全号码 SSN，请不要申请 ITIN。ITIN 由美国国税局颁发，仅用于联邦税收目的。一旦您和/或社会保障局确定个人没有资格获得 SSN，他们必须使用美国国税局表格 W-7“申请美国国税局个人纳税人识别号”申请 ITIN。可以从 IRS 网站 @ http://www.irs.gov/pub/irs-pdf/fw7.pdf 下载并获取副本，其中包含所有说明。虽然在许多情况下，ITIN 申请是在提交联邦纳税申报表的同时提出的，但只要所有所需文件齐全，就可以随时完成。通常需要大约 4-6 周的时间才能完成该流程并获得 ITIN 分配。无论何时提出申请，该流程都涉及填写尽可能多的申请表，然后亲自将其带到位于萨利纳斯的 IRS 地区办事处（或任何其他 IRS 办事处），并附上说明中所述的所有所需文件的原件。然后，IRS 将协助您完成申请并将其邮寄出去进行处理。在前往 IRS 办事处之前，请仔细阅读申请表随附的说明，以确保您拥有所有所需文件。在纳税季节开始之前完成此过程并分配 ITIN 特别有益。通过在提交纳税申报表之前分配 ITIN，VITA 税务中心将能够以电子方式提交您的纳税申报表，您将在 7-10 天内收到应得的任何退税。如果在您提交联邦和州纳税申报表的同时申请 ITIN，您的纳税申报表和任何应得的退税将至少延迟 4-6 周，直到分配 ITIN。如果没有 SSN 或 ITIN，联邦和州纳税申报表都不能以电子方式提交，因此它们不是以电子方式提交的，这迫使您提交两者的硬拷贝。这种硬拷贝提交申报表的方法被称为“纸质提交”，比电子提交慢得多。如果在纳税季节申请 ITIN，ITIN 和纳税申报表的处理时间很有可能会超过 4-6 周。延迟的原因是因为纳税申报表被搁置，直到分配 ITIN 之后。然后，一旦分配了 ITIN 并将其添加到纳税申报表中，就会处理纳税申报表。美国国税局强烈鼓励每个人尽可能以电子方式提交纳税申报表，并已公开宣布只有在所有以电子方式提交的纳税申报表之后才会处理纸质纳税申报表。
