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通过模型植物Physcomitrium（Physcomitrella）Patens
crispr-cas9对于包括模型植物Phantcomitrium patens在内的植物中的基因组编辑非常有价值。然而，使用天然Cas9核酸酶进行的大多数编辑事件对应于小插入和缺失，这一事实是一个限制。CRISPR-CAS9碱基编辑器使真核基因组中的单核苷酸的靶向突变，因此克服了这一限制。在这里，我们报告了两个可编程基础编辑系统，以在p中诱导精确的胞嘧啶或腺嘌呤转化。patens。使用胞嘧啶或腺嘌呤碱基编辑器，可以使用高达55％的效率来实现位点特异性的单基碱基突变，而无需脱离靶向突变。使用APT基因作为编辑的记者，我们可以证明两个基本编辑器都可以在单纯形或多重编辑中使用，从而可以生产具有多种氨基酸变化的蛋白质变体。最后，我们设置了一个共同编辑的选择系统，命名为APRT的修改以报告基因靶向（SMART），最多可在p中进行效率高达90％的效率位点基础编辑。patens。这两个基本编辑者将促进p中的基因功能分析。patens，可以通过单个SGRNA碱基编辑或使用多个SGRNA碱基编辑来生产随机诱变的变体来通过单个SGRNA碱基编辑或用于给定基因的植物学演化进行定位编辑。
改进的主要编辑允许在 Physcomitrium patens 中进行常规可预测的基因编辑
高效、精准的基因编辑是任何反向遗传学研究的黄金标准。最近开发的 Prime Editing 方法，即改进的 CRISPR/Cas9 [成簇的规律间隔的回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白] 编辑方法，已经达到了精度目标，但其编辑率还有待提高。我们提出了一种改进的方法，可在模型植物 Physcomitrium patens 中进行常规 Prime Editing，同时探索潜在的新 Prime Editing 改进。使用标准化的原生质体转染程序，通过直接植物选择评估了针对 APT 报告基因的多种 Prime Editing 向导 RNA (pegRNA) 结构和 Prime Editor 变体。综合起来，Prime Editor 表达的增强、pegRNA 3ʹ 延伸的修改以及在 pegRNA 的逆转录酶模板序列中添加同义突变，可显著提高编辑率，而不会影响编辑质量。此外，我们表明，prime editing 可以通过间接选择来编辑目标基因，正如 Ppdek10 突变体的产生所证明的那样。此外，我们确定植物逆转录转座子逆转录酶能够实现 prime editing。最后，我们首次展示了使用两个独立编码的肽进行 prime editing 的可能性。
苔藓立碗藓 (Physcomitrella) patens - NSF-PAR
自从二十年前发现转基因可以通过同源重组有效整合到小立碗藓基因组中以来，这种苔藓已经成为研究进化发育生物学问题、干细胞重编程和非维管植物生物学的首要模型系统。小立碗藓是第一种基因组测序的非种子植物。凭借这种基因组信息水平，加上分子遗传工具的不断增加，大量反向遗传学研究推动了这种模型系统的使用。最近，许多技术进步为正向遗传学以及小立碗藓中极其高效和精确的基因组编辑打开了大门。此外，经过仔细的系统发育研究表明，小立碗藓是从小立碗藓中进化而来的。因此，该物种应该命名为小立碗藓，而不是小立碗藓。在这里，我们回顾了这些进展，并描述了小立碗藓中正在研究的领域。小檗对植物生物学的影响最大。
通讯 使用 SpCas9-NG 变体扩展 P. patens 中的 CRISPR 工具箱以及在茄科作物中基因和碱基编辑的应用
摘要：基因组编辑已成为多种物种功能研究和植物育种的主要工具。除了通过经典的 CRISPR-Cas9 系统产生敲除外，CRISPR 碱基编辑的最新发展为产生获得功能突变体提供了巨大而令人兴奋的机会。PAM 要求是 CRISPR 技术（如碱基编辑）的一大限制，因为碱基替换主要发生在较小的编辑窗口中。由于精确的单个氨基酸替换可能导致与某些域或农艺性状相关的功能，因此开发具有宽松 PAM 识别的 Cas9 变体对于基因功能分析和植物育种至关重要。最近，识别 NGN PAM 的 SpCas9-NG 变体已在植物中成功测试，主要是在单子叶植物中。在这项研究中，我们研究了 SpCas9-NG 在模式苔藓 Physcomitrella patens 和两种茄科作物（番茄和马铃薯）中对经典 CRISPR 基因敲除和胞嘧啶碱基编辑的效率。我们发现 SpCas9-NG 允许靶向非典型 NGT 和 NGA PAM，大大扩展了基因组编辑的范围。我们在研究中开发的 CRISPR 工具箱为模式植物和作物开辟了新的基因功能分析和植物育种前景。