petricola

岩石栖息菌 Knufia petricola 的基因工程为极端耐受性黑真菌的生物学提供了见解

黑色微菌落真菌（来自 Arthonio-、Dothideo- 和 Eurotiomycetes 的子囊菌）是自然和人为极端栖息地中耐压力和持久的栖息者。它们表现出缓慢的酵母样或分生生长，不形成专门的生殖结构，并在多层细胞壁中积累黑色素 1,8-二羟基萘 (DHN) 黑色素。要了解黑色真菌如何生活、存活、在矿物基质上定殖以及与光养菌相互作用，需要使用遗传方法来测试这些功能和相互作用。我们选择了 Chaetothyriales 的岩石栖息菌 Knufia petricola 作为开发遗传操作方法的模型。在这里，我们报告了通过更高效的多重 CRISPR/Cas9 扩展遗传工具包的情况，使用基于质粒的系统表达 Cas9 和多个 sgRNA，并实施三个抗性选择标记 genR（遗传霉素/ nptII）、baR（草铵膦/ bar）和 suR（氯嘧磺隆/ sur）。通过替换色素合成必需基因有针对性地整合表达构建体，可以对转化体进行额外的颜色筛选。由于消除了 pks1（黑色素），黑粉色筛选被用于启动子研究，使用 GFP 荧光作为报告基因。由于同时消除了 pks1 和 phs1（类胡萝卜素），黑白筛选可以识别包含两个表达构建体的转化体，以进行共定位或双分子荧光互补 (BiFC) 研究。证实了两种 K. petricola White Collar 直系同源物的共定位和相互作用。确定了两个基因间区域 ( igr1 、 igr2 )，其中可以插入表达构建体而不会引起明显的表型。使用 pNXR-XXX 系列质粒和新的兼容入门质粒可以快速轻松地生成表达构建体，适合在其他真菌中广泛实施。这种遗传工具的多样性为黑真菌基因组编码的基因/蛋白质的表达、功能和调控的机制和非常详细的研究开辟了一个全新的视角。