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岩石栖息菌 Knufia petricola 的基因工程为极端耐受性黑真菌的生物学提供了见解
黑色微菌落真菌（来自 Arthonio-、Dothideo- 和 Eurotiomycetes 的子囊菌）是自然和人为极端栖息地中耐压力和持久的栖息者。它们表现出缓慢的酵母样或分生生长，不形成专门的生殖结构，并在多层细胞壁中积累黑色素 1,8-二羟基萘 (DHN) 黑色素。要了解黑色真菌如何生活、存活、在矿物基质上定殖以及与光养菌相互作用，需要使用遗传方法来测试这些功能和相互作用。我们选择了 Chaetothyriales 的岩石栖息菌 Knufia petricola 作为开发遗传操作方法的模型。在这里，我们报告了通过更高效的多重 CRISPR/Cas9 扩展遗传工具包的情况，使用基于质粒的系统表达 Cas9 和多个 sgRNA，并实施三个抗性选择标记 genR（遗传霉素/ nptII）、baR（草铵膦/ bar）和 suR（氯嘧磺隆/ sur）。通过替换色素合成必需基因有针对性地整合表达构建体，可以对转化体进行额外的颜色筛选。由于消除了 pks1（黑色素），黑粉色筛选被用于启动子研究，使用 GFP 荧光作为报告基因。由于同时消除了 pks1 和 phs1（类胡萝卜素），黑白筛选可以识别包含两个表达构建体的转化体，以进行共定位或双分子荧光互补 (BiFC) 研究。证实了两种 K. petricola White Collar 直系同源物的共定位和相互作用。确定了两个基因间区域 ( igr1 、 igr2 )，其中可以插入表达构建体而不会引起明显的表型。使用 pNXR-XXX 系列质粒和新的兼容入门质粒可以快速轻松地生成表达构建体，适合在其他真菌中广泛实施。这种遗传工具的多样性为黑真菌基因组编码的基因/蛋白质的表达、功能和调控的机制和非常详细的研究开辟了一个全新的视角。
Tet‑on 系统用于控制...中的基因表达
摘要 Knufia petricola 是一种黑真菌，它在极端和贫营养环境中定殖在暴露在阳光下的表面。作为生态上重要的异养生物和人造表面上的生物膜形成者，黑真菌形成了最抗性的生物腐烂生物群之一。由于其在无菌培养中生长速度适中，并且有可用的转化和 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑方案，K. petricola 被用于研究嗜极黑真菌和耐极端黑真菌共同的形态生理适应性。在本研究中，实施了细菌衍生的四环素 (TET) 依赖性启动子 (Tet-on) 系统，以实现 K. petricola 中的可控基因表达。通过使用 GFP 荧光、色素合成（黑色素和类胡萝卜素）和恢复的尿嘧啶原养型作为报告基因，研究了 TET 调控构建体的功能性，即剂量依赖性诱导性。新生成的包含 Tet-on 构建体的克隆载体以及 K. petricola 基因组中用于颜色选择或中性插入表达构建体的已验证位点完善了反向遗传学工具箱。通过使用 2A 自裂解肽，可以根据需要从不同的基因组位点或从单个构建体表达一个或多个基因，例如，用于在 K. petricola 细胞中定位蛋白质和蛋白质复合物或使用 K. petricola 作为表达异源基因的宿主。