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全基因组碱基编辑器筛选鉴定酵母中蛋白质丰度的调节剂
摘要 蛋白质是细胞中的关键分子，其丰度不仅在基因表达水平而且在转录后水平受到广泛调控。在这里，我们描述了一种酵母基因筛选方法，该方法能够系统地表征蛋白质丰度调控在基因组中的编码方式。该筛选方法结合了 CRISPR/Cas9 碱基编辑器来引入点突变，并对内源性蛋白质进行荧光标记以方便流式细胞仪读数。我们首先使用单个 gRNA 以及正向和负向选择筛选对酵母中的碱基编辑器性能进行了基准测试。然后，我们研究了 16,452 种基因扰动对代表各种细胞功能的 11 种蛋白质丰度的影响。我们发现了数百种调控关系，包括 GAPDH 同工酶 Tdh1/2/3 与 Ras/PKA 通路之间的新联系。许多已识别的调节因子特定于这 11 种蛋白质中的一种，但我们还发现了一些基因，这些基因在受到扰动时会影响大多数测试蛋白质的丰度。虽然更具体的调控因子通常作用于转录，但广泛的调控因子往往在蛋白质翻译中发挥作用。总的来说，我们的新筛选方法为蛋白质调控网络的组成部分、规模和连通性提供了前所未有的见解。
一种用于检测蛋白质的酵母交配选择方案
最近，出现了一种新的蛋白质蛋白质相互作用研究的方法。可以使用田野和同事开发的“两杂交系统”（1，2）来寻找新的相互作用蛋白质，或者验证和表征可能会根据遗传或生物化学数据关联的蛋白质之间的相互作用。两种杂交系统是一种分子遗传方法，它利用酵母转录因子GAL4的结构柔韧性。GAL4蛋白包含两个结构域，即DNA结合域和转录激活剂结构域。这两个结构域不必成为同一蛋白的一部分来完成转录激活（3）。当两个结构域分别融合到两个无关但相互作用的蛋白质时，由于蛋白质 - 蛋白质相互作用，可以实现转录激活。通常，使用两种杂交系统对新的相互作用蛋白进行搜索是通过将含有UASC的集成拷贝的酵母菌菌株共转换。1J-LACZ报告基因和两个质粒（2，4-6）。一个质粒编码GAL4的DNA结合结构域与感兴趣的蛋白质的融合，而另一个质粒（库质粒）编码GAL4转录激活结构域的融合以随机生成的编码区域。因此，DNA结合结构域融合将与报告基因上游的UASGAL元件结合。如果由文库融合质粒编码的蛋白质与感兴趣的蛋白质相互作用，则转录激活结构域成为报告基因上游的共定位，从而导致转录激活。有效使用两个杂交系统需要产生大量的酵母转化体。由于酵母的转化仍然比细菌的效率低四个数量级，因此对于详尽的cDNA文库筛网来说，转化可能是限制步骤。在本文中，我们设计了一种简单的方法，可以消除对转化的需求，并允许用户搜索
通过设计的对称性扩展蛋白质纳米含量...
多面体蛋白纳米局量作为疫苗平台取得了很大的成功（1-3），并且是生物制剂递送的有前途的车辆（4-7）。因此，人们对设计能够显示大量抗原或包装更大的更大的碳的更大且更复杂的结构有很大的兴趣。然而，常规的多面体是所有亚基都具有相同局部环境的最大闭合结构（8-11），因此访问更大，更复杂的封闭结构需要打破局部对称性。病毒通过在独特的环境（伪对称）（12）中放置化学不同但结构上相似的链条或利用相同的亚基来解决这个问题，或者利用在不同环境中采用不同构象的相同亚基（准对象）（13-15）（13 - 15），以访问具有更高的三角形（T）数量（13）结构（13），具有较大的亚基和互联剂和较大的子燃料。设计更大，更复杂的纳米焦点的一种有希望的途径是从定期的多面体纳米局（t = 1）开始，该纳米局（t = 1）是由对称的同构构构建块构建的，这些构建块的分离式环状布置是通过在假异构的异构体中代替这些构建块的隔离循环排列，然后通过将t = 4和大型结构与其他结构结合在一起，并与这些其他结构相结合。在这里，我们提供了这种设计方法的高级几何概述，以说明如何使用设计多样性和设计经济之间的权衡方向来实现不同的设计成果，正如在两篇随附的论文中实验证明的那样，Lee等人（16）和Dowling等人（17）。
蛋白质泛素化在肺癌肿瘤发生和靶向药物发现中的作用
恶性肺癌发病率高，5年生存率极差。人类细胞内约80%-90%的蛋白质降解是通过泛素化酶途径进行的，特异性极高的泛素连接酶（E3）在靶蛋白的泛素化过程中起着至关重要的作用，泛素化通常发生在底物蛋白的赖氨酸残基上。不同的泛素化形式对靶蛋白的影响不同，多个短链泛素化残基修饰底物蛋白，是蛋白质降解的有利信号。细胞内蛋白质泛素化与去泛素化之间适应生理需要的动态平衡，有利于生物体的健康。蛋白质泛素化对许多生物学途径都有影响，这些途径的失衡导致包括肺癌在内的疾病。抑癌蛋白因子的泛素化或肿瘤致癌蛋白因子的去泛素化往往导致肺癌的进展。泛素蛋白酶体系统（UPS）是肺癌新型抗癌药物研发的宝库，尤其是针对蛋白酶体和E3s，精准靶向的致癌蛋白泛素化降解可能为肺癌药物研发提供光明的前景；特别是蛋白水解靶向嵌合（PROTAC）诱导的蛋白质降解技术将为肺癌新型药物的研发提供新的策略。
开发载脂蛋白E模拟肽 - 脂质结合物，以有效地递送L
抽象脂质体是可以封装各种药物的多功能载体。但是，要向大脑传递，必须通过靶向配体或其他修饰进行修饰，以提供血脑屏障（BBB）的渗透性，同时避免通过聚乙烯甘油（PEG）修饰通过网状内皮系统快速清除。BBB渗透肽充当脑靶向配体。在这项研究中，为了实现脂质体有效的大脑递送，我们基于使用体外BBB通透性评估系统的高通量定量评估方法，筛选了先前报道的八个BBB渗透肽的功能，该方法使用Transwell，在原位脑灌注系统等。For apolipoprotein E mimetic tandem dimer peptide (ApoEdp), which showed the best brain-targeting and BBB permeability in the comparative evaluation of eight peptides, its lipid conjugate with serine–glycine (SG) 5 spacer (ApoEdp-SG-lipid) was newly synthesized and ApoEdp-modified PEGylated liposomes were准备。apoEDP修饰的卵子脂质体有效地与人脑毛细血管内皮细胞通过ApoEDP序列有效相关，并在体外BBB模型中渗透了膜。此外，在大脑中积累的apoEDP修饰的卵形脂质体比小鼠中的脂肪体高3.9倍。此外，通过三维成像和组织清除，证明了apoEDP修饰的pe乙型脂质体在小鼠中局部将BBB局部局部到脑实质中的能力。这些结果表明，ApoEDP-SG脂质修饰是一种有效的方法，它可以赋予具有脑靶向能力和BBB渗透性的质脂质体。
病毒编码的蛋白酶和Nidovirales中的蛋白水解加工
基于基因组结构和复制策略的相似性，RNA病毒如今可分为“超类群”，通常涵盖动物病毒和植物病毒（Goldbach & Wellink，1988；Strauss & Strauss，1988）。这一概念也越来越多地体现在病毒分类学中；尤其是引入了分类单元“目”，将很可能拥有共同祖先的病毒科合并在一起（Mayo & Pringle，1998）。对于正链、有包膜的冠状病毒和动脉炎病毒（最近被统一归入巢病毒目，Cavanagh，1997），基于相似的多顺反子基因组结构、共同的转录和（后）翻译策略以及一系列同源复制酶结构域的保守性（den Boon et al.，1991），它们之间建立了密切的系统发育关系。因此，有可能勾勒出nidovirus生命周期的共同轮廓（图1）（详见Lai & Cavanagh，1997；de Vries et al.，1997；Snijder & Meulenberg，1998）。然而，在某些方面，这两个病毒家族彼此之间存在显著差异。例如，最大的冠状病毒基因组，鼠肝炎病毒（MHV），其基因组为31±5kb，约为最小动脉炎病毒基因组，即马动脉炎病毒（EAV）12±7kb RNA的两倍半。此外，这两个病毒家族的结构蛋白没有明显的相关性，导致病毒体的大小和结构存在重要差异（den Boon et al.，1991；Snijder & Spaan，1995；de Vries et al.，1997）。大多数主要的动物正链RNA病毒群体要么产生单个多聚蛋白，要么产生单独的非结构和结构前体多肽，这些多肽随后被病毒编码或宿主编码的蛋白酶裂解，产生功能性亚基(Dougherty & Semler, 1993)。相比之下，在基因组3′-近端区域编码的nido病毒结构蛋白，
使用...
dnaprotein交叉链接（DPC）是非常常见的DNA病变，会干扰所有DNA交易，包括复制和转录。受损DNAPROTEIN交联修复（DPCR）的后果很严重。在细胞水平上，DPCR受损会导致双链断裂，基因组不稳定性和/或细胞死亡的形成，而在有机体水平上，DPCR缺乏与癌症，衰老和神经变性有关。诱导DPC用于医学治疗许多癌症，并了解有机体水平的修复可能会为开发新药和联合疗法与当前使用的化学治疗剂的开发提供动力。We use zebrafish (Danio rerio), an established vertebrate model to study cancer, neurodegenerative and cardiovascular diseases, and CRISPR/Cas gene editing to knockout or mutate genes of interest in order to study the interplay of DPCR factors and subpathways including proteolysis, and tyrosylDNA phosphodiesterasedependent repair at the biochemical and cellular level.i将介绍我们最近的发现，从CRISPRCAS系统产生的三种新的斑马鱼菌株：催化突变体和参与DPCR的ACRC蛋白酶的C端突变体，以及具有无活性DPCR因子的转基因菌株，无效的DPCR因子，酪液NA磷酸二酯酶1（TDP1）。我们发现ACRC是脊椎动物发育中的必不可少的蛋白酶，因为催化突变会导致早期的胚胎致死性。通过将ACRC（WT）mRNA构建体注射到突变胚胎中，我们能够种植转基因线并执行DPCR分析。我们发现ACRC是具有许多细胞底物的DPCR蛋白酶，SPRTT结构域对于修复至关重要，而本质上无序的区域是可分配的。我们还表明，TDP1是在有机体水平分辨出拓扑异构酶1和HistonedPC所必需的，并且我们进一步表征了一种新型的TDP1介导的修复途径，用于HistonedPC修复。
基于融合蛋白的 COVID-19 疫苗以...为例
在本文中，我们讨论了基于融合蛋白的 SARS-CoV-2 疫苗的特征。我们重点研究了重组疫苗抗原，该疫苗抗原由融合蛋白组成，融合蛋白由 SARS-CoV-2 衍生的抗原或肽的组合或 SARS-CoV-2 抗原/肽与 SARS-CoV-2 无关的蛋白质/肽的组合组成。这些融合蛋白是为了增加疫苗抗原的免疫原性和/或实现免疫系统的特殊靶向性。基于蛋白质的疫苗方法仅在概念验证研究中得到举例说明，该研究使用 W-PreS-O，一种基于单一融合蛋白 (W-PreS-O) 的嵌合疫苗，将来自武汉 hu-1 野生型和 Omicron BA.1 的 RBD 与吸附于氢氧化铝的乙肝病毒 (HBV) 衍生的 PreS 表面抗原相结合。在感染 Omicron BA.1 之前，对叙利亚仓鼠进行了 W-PreS-O 疫苗评估，这些仓鼠每隔三周接种 W-PreS-O 或氢氧化铝（安慰剂）三次。通过 RT-PCR 测量上呼吸道和下呼吸道的中和抗体 (nAB) 滴度、体重、肺部症状和病毒载量。此外，还使用斑块形成试验测量了肺部的传染性病毒滴度。我们发现接种 W-PreS-O 疫苗的仓鼠产生了针对 Omicron BA.1 的强效 nAB，几乎没有出现肺炎，并且肺部的传染性病毒滴度显著降低。重要的是，接种 W-PreS-O 疫苗的仓鼠鼻腔中的病毒载量接近或高于 PCR 循环阈值
膜蛋白质 - 含量的定量，时间分辨测量
图。5：用酪蛋白钝化的悬臂背面的AFM图像在0.5pm T5溶液的溶液中孵育1.5h（箭头标记T5噬菌体或可能的酪蛋白聚集体）请注意，这里的条件与手稿中呈现的原位实验不同。
Rho GTPases及其效应蛋白
使用的缩写：ACK，激活的CDC42相关酪氨酸激酶； GEF，鸟苷核苷酸交换因子； PH，Pleckstrin同源性； DH，DBL同源性； PIP 2，磷脂酰肌醇4,5-双磷酸；间隙，GTPase激活蛋白； GDI，鸟苷核苷酸解离抑制剂； SRF，血清反应因子； NF-κB，核因子κB； Jnk，c-jun n末端激酶；婴儿床，cdc42/rac-Interactive结合； REM，Rho ectector同源性； RKH，ROK – Kinectin同源性； MLC，肌球蛋白轻链； PI-4-P5K，磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶； GTP [s]，鸟嘌呤5« - [γ -thio]三磷酸； MAP激酶，有丝分裂原激活的蛋白激酶； MLK，混合细胞激酶； ACC，反平行线圈； BTK，布鲁顿的酪氨酸激酶； MBS，肌球蛋白结合亚基； ERM，Ezrin/radixin/Moesin; FH，形态学；黄蜂，Wiskott-Aldrich-Syndrome蛋白；波浪，黄蜂样的垂直蛋白质蛋白； lim激酶； EGF，表皮生长因子； TNFα，肿瘤坏死因子α； Mekk，地图激酶激酶激酶； PAK，P21激活的激酶； PKN，蛋白激酶N； MRCK，肌发育症激酶相关的CDC42结合激酶。1应向谁致辞（电子邮件Anne.bishop！ucl.ac.uk）。