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一种多功能、高效的植物原生质体平台...
基因组编辑技术发展的最终目标是实现任何细胞或生物体中精准的基因组改变。本文我们描述了原生质体系统，该系统利用预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物在拟南芥、本氏烟、白菜和亚麻荠中实现精准、高效的 DNA 序列改变。Cas9 RNP 介导的双 gRNA 基因破坏在拟南芥原生质体中可达到约 90% 的插入/缺失。为了便于测试任何 Cas9 RNP 设计，我们开发了两个 GFP 报告基因，从而可以灵敏地检测非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复 (HDR)，编辑效率分别高达 85% 和 50%。当与最佳单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 供体共转染时，RNP 通过 HDR 对 AtALS 基因的精确编辑达到 7%。值得注意的是，预组装引物编辑器 (PE) RNP 介导的精确诱变导致原生质体中 GFP 报告基因回收率为 50%，基因组中特定 AtPDS 突变的编辑频率高达 4.6%。原生质体中 CRISPR RNP 变体的快速、多功能和高效基因编辑为开发、评估和优化基因和基因组操作的新设计和工具提供了宝贵的平台，适用于多种植物物种。
基因组编辑项目设计的一般准则和实用技巧.docx
方法。第一种方法是将含有 loxP 位点的 ssODN 引入目标外显子两侧的 5' 和 3' 位点。这是通过使用 2 个 sgRNA 完成的。第二种方法使用含有 2 个 loxP 位点的 lssDNA 模板，这 2 个 loxP 位点位于目标 DNA 序列两侧。这种方法使用了 2 个 sgRNA。B. UTSW 转基因核心提供给您的试剂：您向核心支付的 CRISPR 服务费用包括我们用于完成您的项目的 IDT Sp. Cas9 蛋白的费用。如果您的项目涉及使用不同的编辑酶（如 Cas12 或 Cpf），请联系核心工作人员更详细地讨论该项目。C. 了解您的基因的重要细节：使用基因组浏览器（如 NCBI、UCSC 或 ENSEMBl）收集有关您的目标基因的相关信息。这包括任何替代转录本、外显子的数量和重要性、位于特定内含子中的调控基序以及编码序列等细节，以便成功设计 sgRNA 和供体 DNA 模板。使用 MGI- 小鼠基因组信息学来确定是否存在与靶基因敲除相关的已知表型非常重要。了解基因的 KO 是否可能导致致命表型（无论是胚胎还是出生后早期）尤为重要。了解并将此信息传达给核心人员将使我们能够修改用于生成小鼠突变株的条件，以便我们主要创建 KO 等位基因杂合的小鼠。D. sgRNA 的设计：注射受精卵中发生的基因组编辑的效率在很大程度上取决于针对靶标的 sgRNA 的正确设计。此设计的关键组成部分包括：
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囊性纤维化（CF）是由CF跨膜电导调节剂（CFTR）基因突变引起的罕见疾病。在法国，超过80％的CF患者是纯合或杂合状态中F508DEL突变的载体。f508del导致过早降解但其他功能性蛋白质的合成。现在有很大的兴趣实施CFTR校正器，旨在营救顶部膜中的F508DEL。有些处于临床状态，但仍处于适度效率。需要使用相关的CF动物模型来对这些新化合物进行临床前研究。CF小鼠模型表现出几种相关的疾病，但无法模仿严重的肺部疾病：因此，已经开发了其他模型作为猪和雪貂中的CF。这两个物种都表现出有趣的气道障碍，但它们需要专门的设施和管理，这些设施和管理不容易获得，并带来了高昂的成本。此外，由于其剧烈的肠道疾病，只有少数动物达到成年年龄。最近，已经开发出了一条敲除（KO）大鼠，该大鼠在人类受试者中发现了许多CF表型的特征，包括气道粘液产生，气管发育，气道表面和周围液体液深，鼻粘液，牙齿，牙齿，牙齿，牙齿牙齿的缺陷以及VAS deferens的参与。大鼠是CF肺部疾病的有吸引力的模型，因为与小鼠不同，但与人类相似，它们在整个气管中都会形成广泛的粘膜下腺，直至支气管水平。尽管如此，CFTR-KO大鼠不允许研究校正器。F508DEL大鼠将通过Nantes的Trip Platform实现。因此，我们旨在使用F508DEL突变和单链寡脱氧核苷酸（SSODN）开发CF大鼠模型，该方法将与群集的定期散布的短palindromic重复（CRISPR）共同注入。这种新模型将使我们能够加深对由F508DEL突变引起的CF生理病理学的知识，尤其是关于肺部疾病和其他CFTR相关异常的知识。此外，F508DEL大鼠模型将使我们能够测试校正器对另一种模型中CF病理的影响，从而提供了有关其功效，代谢和毒性的有价值的补充数据。这种F508DEL大鼠模型将是世界上第一个模型，并构成了CF研究的重大进展。
一种适用于 iPSC 疾病建模的高效 CRISPR-Cas9 DNA 编辑方法
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