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通过 CRISPR-Cas9 敲除斯氏按蚊免疫基因 LRIM1 揭示了其在繁殖和媒介能力方面的意外作用
PfSPZ 疟疾疫苗由使用无菌饲养的按蚊制造的恶性疟原虫 (Pf) 子孢子 (SPZ) 组成。按蚊的免疫反应基因，例如富含亮氨酸的蛋白质 (LRIM1)，通过支持动合子的黑化和吞噬作用来抑制蚊子体内的疟原虫 SPZ 发育 (孢子生殖)。为了增加 PfSPZ 感染强度，我们通过使用 CRISPR-Cas9 进行胚胎基因组编辑，生成了 A . stephensi LRIM1 敲除系 Δ aslrim1 。Δ aslrim1 蚊子的中肠细菌负荷显著增加，微生物组组成发生改变，包括共生乙酸菌的消除。微生物组的改变导致蚊子死亡率增加，并且出乎意料地显著减少了孢子生殖。通过对蚊子进行抗生素治疗，Δ aslrim1 蚊子的存活率及其支持 PfSPZ 发育的能力得到部分恢复，而当 Δ aslrim1 蚊子在无菌条件下生产时，其存活率和支持 PfSPZ 发育的能力则完全恢复到基线。LRIM1 的缺失也会影响生殖能力：产卵、生育力和雄性生育力受到严重损害。生育力的减弱与改变的微生物组无关。这项研究表明，LRIM1 对微生物组的调控对 A . stephensi 的媒介能力和寿命有重大影响。此外，LRIM1 的缺失还发现了该基因在生育力和减少雄性精子转移方面的意外作用。
数字液滴 PCR 和 IDAA 用于检测疟疾物种斯氏按蚊中的 CRISPR 插入/缺失编辑
摘要 CRISPR/Cas9 技术是设计基因驱动系统以控制和/或改变蚊媒种群的有力工具；然而，CRISPR/Cas9 介导的非同源末端连接突变可能对产生抗驱动的等位基因产生重要影响，从而对驱动效率产生重要影响。我们展示并比较了两种技术在疟疾媒介蚊子斯氏按蚊中的插入或缺失 (indel) 检测能力：扩增子分析插入缺失检测 (IDAA™) 和液滴数字™ PCR (ddPCR™)。这两种技术在含有不同比例和不同大小的插入缺失的蚊子样本中都显示出插入缺失频率的准确性和可重复性。此外，这些技术具有优势，使它们可能更适合在基因驱动蚊子的笼养试验和封闭式现场测试中进行高通量非同源末端连接分析。
通过 ReMOT 控制对疟蚊 Anopheles stephensi 进行 Cas9 介导的基因编辑
摘要 创新工具对于推进疟疾控制至关重要，并且取决于对疟蚊传播疟原虫的分子机制的理解。基于 CRISPR/Cas9 的基因破坏是一种揭示媒介-病原体相互作用的潜在生物学原理的有效方法，其本身可以成为蚊虫控制策略的基础。然而，用于对蚊子（尤其是疟蚊）进行基因改造的胚胎注射方法既困难又低效，特别是对于非专业实验室而言。在这里，我们采用了 ReMOT 控制（受体介导的卵巢货物转导）技术，将 Cas9 核糖核蛋白复合物递送至成年蚊子卵巢，从而无需注射胚胎就在疟疾媒介斯氏疟蚊中产生有针对性的可遗传突变。在疟蚊中，ReMOT 控制基因编辑与标准胚胎注射一样有效。 ReMOT 控制对按蚊的应用，为缺乏设备或专业知识进行胚胎注射的疟疾实验室揭示了 CRISPR/Cas9 方法的威力，并建立了 ReMOT 控制对不同蚊子物种的灵活性。