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预扭转以改善基因组修饰和 miRNA 靶向
作为新的治疗方式，需要精确靶向 DNA 和 RNA 序列的调控工具。PNA（图 1 A、B）[ 1 ] 最初由 Nielsen 等人于 1991 年开发，在靶向疾病相关 DNA 和 RNA 序列方面显示出巨大潜力。PNA 可以与天然 DNA/RNA 序列配对，形成 PNA-DNA 和 PNA-RNA 双链。与具有三个或四个手性中心的 DNA/RNA 糖环部分相比，典型的 PNA 没有环结构或手性中心。相对灵活且电中性的骨架使 PNA 有利于通过 Watson-Crick 碱基配对识别具有平行和反向平行链取向的 DNA/RNA 序列，并具有增强的结合亲和力。此外，PNA 通过三链结构形成识别 DNA 和 RNA 序列（例如，PNA • DNA-PNA、PNA • RNA-PNA、PNA • RNA-RNA 和 PNA • DNA-DNA 三链；此处 - 和 • 分别表示 Watson-Crick 和 Hoogsteen 对）。通常，PNA 与蛋白质没有显著结合，因此无免疫原性，并且对蛋白酶和核酸酶具有抗性。
使用息肉素反向Hoogsteen发夹技术对点突变的基因校正
单基因疾病通常是特定基因单点突变的结果，导致非功能蛋白的产生。不同的血液疾病，例如β-丘脑贫血，镰状细胞病，遗传性球细胞增多症，fanconi贫血和血友病A和B，通常是由点突变引起的。基因编辑工具，包括Talens，ZFN或CRISPR/CAS平台，以纠正负责不同疾病的突变。然而，不依赖核酸酶活性的替代分子工具，例如形成三核苷酸及其衍生物（例如肽核酸），也证明了它们在DNA中纠正突变的能力。在这里，我们回顾了修复 - 螺肽反向Hoogsteen发夹（PPRHS）技术，该发夹可以代表该领域内的替代基因编辑工具。修复-PPRHS是由由五甲状腺素桥连接的两个息肉素镜重复序列形成的单链DNA分子，然后在分子的一端进行扩展序列，该序列是与DNA序列同源的，但要修复了DNA序列，但含有修复的DNA序列。PPRH的两个息肉臂由嘌呤之间的分子内反间隔键结合，从而形成了发夹结构。该发夹芯与watson-crick键以序列特异性方式与dsDNA中靶突变相对近乎近距离突变结合，从而产生了刺激重组的三重结构。这项技术已成功地用于修复其内源性基因座中DHFR和APRT基因突变体在哺乳动物细胞中的集合，并且可以适合校正负责血液疾病的突变。
ACtivE：使用最少试剂和时间进行酵母基因组工程的组装和 CRISPR 靶向体内编辑
摘要：由于其复杂性，CRISPR/Cas 系统已成为广泛使用的酵母基因组编辑方法。然而，CRISPR 方法通常依赖于预组装的 DNA 和额外的克隆步骤来传递 gRNA、Cas 蛋白和供体 DNA。这些繁琐的步骤可能会阻碍其实用性。在这里，我们提出了一种替代方法，即组装和 CRISPR 靶向体内编辑 (ACtivE)，该方法仅依赖于线性 DNA 片段的体内组装来构建质粒和供体 DNA。因此，根据用户的需要，可以从存储库中轻松选择和组合这些部分，作为快速基因组编辑的工具包，无需任何昂贵的试剂。该工具包包含经过验证的线性 DNA 片段，易于在室温下存储、共享和运输，大大降低了昂贵的运输成本和组装时间。优化该技术后，还对酵母基因组中靠近自主复制序列 (ARS) 的八个基因座进行了整合和基因表达效率表征，以及这些区域的破坏对细胞适应性的影响。通过构建 β-胡萝卜素途径展示了 ACtivE 的灵活性和多路复用能力。在短短几天内，在酿酒酵母 BY4741 上从头开始实现了单基因整合效率 >80% 和三重整合效率 >50%，无需使用体外 DNA 组装方法、限制性酶或额外的克隆步骤。本研究提出了一种可轻松用于加速酵母基因组工程的标准化方法，并为酵母合成生物学和代谢工程目的提供了明确的基因组位置替代方案。关键词：酿酒酵母、CRISPR 工具包、基因组编辑、合成生物学、标准化、基因座表征■简介