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World File Search System克隆
Fast-Fusion™ Multi 无缝克隆试剂盒使用说明书
商标：GeneCopoeia™、OmicsLink™、Secrete-Pair™、GLuc-ON™、miTarget™、Fast-Fusion™（GeneCopoeia Inc）。FF006-091224
克隆载体
1. 质粒 质粒是自然产生的染色体外 DNA 片段，可以稳定地从一代传到另一代。质粒携带编码抗生素、某些毒素或重金属抗性的基因，或产生 DNA 限制和修饰酶的基因。质粒的拷贝数可以从 1-2 到多个拷贝 (10-200)/细胞不等。质粒用于克隆不超过 10 Kb 的小片段 DNA，该片段位于称为多接头的位点，多接头是一小段 DNA，其中包含许多限制位点，质粒可以用任何限制酶切割这些位点，然后将所需的 DNA 连接到该位点。 pBR322 质粒 pBR322 是 1977 年创建的第一个大肠杆菌中常用的载体。它是一个小质粒（4361 bp），每细胞含有 15-20 个拷贝数，pBR322 还含有复制起点，并带有对氨苄青霉素和四环素的两个抗生素抗性基因。该质粒具有超过 40 种限制性酶的独特限制位点。
克隆实验手册
1) 将大肠杆菌培养液（高拷贝质粒：2-10 ml）离心（12,000 x g，30秒），弃上清，得到沉淀。 ↓ ②加入150 μl A1 buffer（加RNase A），涡旋悬浮细胞。 ↓ ③加入250μl A2缓冲液，颠倒混合5次左右，静置2分钟。 [裂解] ↓ ④ 加入350 μl A3缓冲液，颠倒混匀，直至液体由蓝色变为完全无色。检查是否没有蓝色残留，然后离心（12,000 x g，3 分钟）。 ↓ ⑤将上清液转移到NucleoSpin® Plasmid EasyPure 柱中，离心（1,000-2,000 × g，30 秒）。 [结合] ↓ ⑥ 加入450 μl AQ缓冲液（+EtOH）并离心（12,000 × g，1分钟）。 [洗涤/干燥] ↓ ⑦向柱中加入50 μl AE缓冲液，室温下放置1分钟。 ↓ ⑧ 离心（12,000×g，1分钟）回收质粒溶液。 [洗脱]
GO-CRISP 克隆协议
使用下面的引物模板（表 1），片段 2 可以通过 PCR 扩增（图 4A）。我们建议使用 gRNA NIA TLS1/2 作为 PCR 模板。“NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN”（表 1）代表应由 gRNA 靶序列替换的核苷酸。用于创建 NIA1 靶向片段 2 的引物列于下方作为示例（表 1）——这些引物用于创建 gRNA NIA TLS1/2。引物还在片段末端添加了 BsaI 切割位点（图 4A），这些位点与 gRNA 片段 1 TLS1/2 中的双 BsaI 位点兼容。
炎症和克隆的基因改造......
潜力不确定的克隆造血 (CHIP) 与心血管疾病 (CVD) 风险增加有关，据推测是通过炎症小体激活实现的。我们对 424,651 名英国生物银行参与者进行了炎症基因修饰扫描，以寻找 CHIP 相关的 CVD 风险。我们使用血液 DNA 的全外显子组测序数据确定了 CHIP，并将其作为一个复合模型进行建模，将所有驱动基因一起考虑，也分别考虑常见的驱动基因（ DNMT3A 、 TET2 、 ASXL1 和 JAK2 ）。我们为 26 个炎症小体相关基因开发了预测基因表达评分，并评估了它们如何改变 CHIP 相关的 CVD 风险。我们确定 IL1RAP 是跨基因 CHIP 相关 CVD 风险的潜在关键分子，并且 AIM2 基因表达增加导致 JAK2 和 ASXL1 相关的 CVD 风险增加。我们发现，CRISPR 诱导的 Asxl1 突变小鼠巨噬细胞对 AIM2 激动剂的炎症反应特别强烈，与 DNA 损伤反应增强以及 IL-10 分泌增加有关，反映了 ASXL1 CHIP 中 IL10 表达的 CVD 保护作用。我们的研究支持炎症小体在 CHIP 相关 CVD 中的作用，并提供了证据来支持针对 CHIP 相关 CVD 风险的基因特异性策略。
分子克隆的历史
1。Bertani，G。和Weigle，J.J。 （1953）J。细菌。 65，113–121。 2。 Luria，S.E。 和人类，M.L。 （1952）J。细菌。 64，557–569。 3。 Clouds，G.，Shichi，M.L。 和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国，47，869–878。 4。 Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Bertani，G。和Weigle，J.J。 （1953）J。细菌。65，113–121。2。Luria，S.E。 和人类，M.L。 （1952）J。细菌。 64，557–569。 3。 Clouds，G.，Shichi，M.L。 和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国，47，869–878。 4。 Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Luria，S.E。和人类，M.L。（1952）J。细菌。64，557–569。3。Clouds，G.，Shichi，M.L。 和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国，47，869–878。 4。 Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Clouds，G.，Shichi，M.L。和Weigle，J.J。 （1961）natl。学院。SCI。 美国，47，869–878。 4。 Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国，47，869–878。 4。 Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。美国，47，869–878。4。Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961） natl。 学院。 SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Meselson，M。和Weigle，J.J。 （1961）natl。学院。SCI。 美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国47，857–868。 5。 课程，N.R。等。 al。 （1967）生物化学。 生物。 res。 公社。 28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。美国47，857–868。5。课程，N.R。等。al。（1967）生物化学。生物。res。公社。28，578–586 6。 公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。28，578–586 6。公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。公司，M.L.，Becker，A。和Hurwitz，J。（1967）Proc。natl。学院。SCI。 美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国58，240-247。 7。 代表，M。（1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。美国58，240-247。7。代表，M。（1967）Proc。natl。学院。SCI。 美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国57，148–155。 8。 Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。美国57，148–155。8。Olive，B.M。 和Lehman，I.R。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Olive，B.M。和Lehman，I.R。（1967）Proc。natl。学院。SCI。 美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国57，1426–1433。 9。 Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。美国57，1426–1433。9。Weiss，B。和Richardson，C.C。 （1967）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Weiss，B。和Richardson，C.C。（1967）Proc。natl。学院。SCI。 美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国57，1021–1028。 10。 Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。 natl。 学院。 SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。美国57，1021–1028。10。Line，S。和Arbre，W。（1968）Proc。natl。学院。SCI。 美国59，1300–1306。 11。 史密斯，H.O。 和Wilcox，K.W。 （1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。SCI。美国59，1300–1306。11。史密斯，H.O。和Wilcox，K.W。（1970）J。Mol。 大。 51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。（1970）J。Mol。大。51，379–391。 12。 Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。51，379–391。12。Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。Danna，K。和Nathans，D。（1971）Proc。natl。学院。SCI。 美国68，2913–2917。 13。 Mandel，M。和Higa，A。 （1970）J。Mol。 生物。 1970，53，159–162。SCI。美国68，2913–2917。 13。 Mandel，M。和Higa，A。 （1970）J。Mol。 生物。 1970，53，159–162。美国68，2913–2917。13。Mandel，M。和Higa，A。（1970）J。Mol。 生物。 1970，53，159–162。（1970）J。Mol。生物。1970，53，159–162。