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简单的电穿孔即可在小鼠受精卵中实现高效的 CRISPR/Cas9 基因组编辑
受精卵电穿孔是小鼠中 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑中复杂的原核注射程序的快速替代方法。然而，目前的电穿孔方案要么需要投资专门的电穿孔仪，要么需要对受精卵进行腐蚀性预处理，这会损害胚胎的活力。在这里，我们描述了一种易于适应的方法，通过使用带有合成 CRISPR/Cas9 组件的普通电穿孔仪对完整的受精卵进行电穿孔，高效地在小鼠中引入特定突变，并且技术要求最低。该方案可有效处理来自各种遗传背景的受精卵，并与其他 CRISPR 核酸酶（如 Cas12a）兼容。
世界的第一个！成功地从受精小鼠卵中取出异常染色体
通常很难使用这些指标选择好的胚胎。因此，有必要阐明异常染色体分离的原因并防止异常胚胎的形成。迄今为止，为了研究异常分离的染色体和微核，已经进行了分析，包括使用一个受精卵的一个细胞对基因进行全面分析，以及对用福尔马林固定的受精卵的染色体观察的荧光观察。但是，由于综合细胞基因表达分析无法区分正常和异常的染色体，并且通过荧光观察观察异常的染色体仅允许分析一部分异常染色体，因此无法详细检查异常染色体。因此，在这项研究中，我们开发了一项技术，可以从染色体异常的小鼠2细胞阶段中去除微核，而无需杀死胚胎，并试图分析遗传切除的微核。
优化电穿孔参数，使用 3 至 2000 kDA 的荧光葡聚糖将大分子有效递送至猪受精卵中
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。
鉴定，分离和提取从卵中产生细菌并用于染色的色素的
本研究旨在将细菌从白色的卵中分离出来，这些细菌可以产生颜料，并可能在纺织工业中用作染料。通常，细菌出于各种原因产生色素，并且起着重要作用。细菌产生的一些色素显示出针对病原体的抗菌活性。这些细菌产生的这些抗菌剂或物质成功地用于预防和治疗微生物疾病。诸如类胡萝卜素，黑色素，黄素，维紫素，protigiosin之类的色素对许多致病细菌显示出明显的抗菌作用。被污染的卵可能会产生细菌，例如沙门氏菌属，proteus spp。，bacillus spp。，pseudomonas spp。和葡萄球菌属，它们的鞭毛可以使它们穿过毛孔。通过使用有机溶剂提取这些细菌，并以薄层色谱法进行纯化和特征，并优化为染色参数。获得的染料是化学染料的替代来源。
trpv3和cav3.2离子通道在小鼠卵中功能相互作用
6 Centro de Investigación de Estudios Avanzados del Maule, Universidad Católica del Maule, 3480112 Talca, Chile Oocyte maturation or the acquisition of meiotic competence requires a controlled expression of proteins that supports this process in preparation for fertilization.两者均由高度调节的离子稳态确定卵母细胞的成熟和受精。几个离子通道，调节多种细胞过程，据报道在包括哺乳动物在内的不同物种的卵中表达。受精始于成熟卵母细胞中的精子 - 特异性磷脂酶（PLC）。Ca 2+流入需要在卵母细胞中积聚Ca 2+以准备受精，并在受精过程中补充其细胞内存储，从而支持Ca 2+振荡和卵子激活。卵子激活包括在其他过程之间形成前核，皮质颗粒外胞菌病，多植物的封闭性和减数分裂II，以支持向早期胚胎发育过渡的其他过程。电压门控活化的钙通道Cav3.2通道已被表达，并有助于对钙储存的补充，以准备小鼠卵中的受精。此外，已经显示出在小鼠卵中表达的阳离子非选择性通道TRPV3的瞬态受体通道TRPV3（一种阳离子非选择性通道），但是其生理功能目前尚不清楚。在这里，我们表明TRPV3和CAV3.2在小鼠卵中功能相互作用。使用缺乏TRPV3和CAV3.2蛋白的卵，我们评估它们在皮质颗粒分布中的作用。方法：使用KO动物模型，共焦显微镜，生物信息学和斑块钳电生理学，我们测试了离子通道在小鼠卵中的表达和功能，并评估了它们在皮质颗粒动力学中的作用。结果：TRPV3KO卵中的Cav3.2 -20 mV时的Cav3.2电流显着降低（8pa/pf wt卵，trpv3ko卵中的3,75 pa/pf）。TRPV3电流（41 pa/pf在wt中为41 pa/pf，而在cav3.2ko卵中的30,5 pa/pf）。trpv3ko卵显示，与WT卵相比，标记为透镜culinaris凝集素的荧光强度测量的质膜中的CG密度显着降低。生物信息学方法揭示了CAV3.2和TRPV3蛋白之间物理相互作用的可能位点/残基。我们的结果表明，Cav3.2和TRPV3的功能和/或物理相互作用可能将关键细胞过程调节为皮质颗粒分布，在哺乳动物中卵向胚胎过渡的基础。致谢：Fondecyt 1221308; Fondequip Anid EQM200122
通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到体外受精的受精卵中有效生成 GGTA1 缺陷猪
背景：异种抗原是种间异种移植成功的主要问题。GGTA1 编码 α 1,3-半乳糖基转移酶，该酶对半乳糖基-α 1,3-半乳糖的生物合成至关重要，而半乳糖是导致超急性排斥的主要异种抗原。因此，GGTA1 修饰猪是猪对人异种移植的有希望的供体。在本研究中，我们开发了一种通过电穿孔将 CRISPR/Cas9 系统引入体外受精猪受精卵以生成 GGTA1 修饰猪的方法。结果：我们设计了五种针对 GGTA1 中不同位点的向导 RNA (gRNA)。通过电穿孔将 Cas9 蛋白与每一种 gRNA 一起引入后，评估了受精卵发育成的囊胚中的基因编辑效率。使用基因编辑效率最高的 gRNA 生成 GGTA1 编辑猪。在用 Cas9/gRNA 复合物转移电穿孔受精卵后，两头受体母猪产下六头仔猪。深度测序分析显示，六头仔猪中有五头在 GGTA1 的目标区域携带双等位基因突变，没有脱靶事件。此外，用异凝集素 B4 染色证实了 GGTA1 双等位基因突变猪的 GGTA1 功能缺陷。