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使用病毒复制子进行全基因组 CRISPR 敲除筛选 1
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是由此预印本的版权持有者于 2025 年 1 月 11 日发布的。 ; https://doi.org/10.1101/2025.01.09.632058 doi：bioRxiv 预印本
安全有效的二合一复制子和 VLP 微刺突疫苗
大型 SARS-CoV-2 刺突 (S) 蛋白是当前 COVID-19 候选疫苗的主要靶标，但可诱导非中和抗体，这可能导致疫苗引起的并发症或 COVID-19 疾病的加重。此外，在具有复制能力的病毒载体疫苗中编码功能性 S 可能会导致出现具有改变或扩大的趋向性的病毒。在这里，我们开发了一个安全的单轮弹状病毒复制子疫苗平台，用于增强 S 受体结合域 (RBD) 的呈递。采用结构引导设计来构建嵌合微刺突，该微刺突包含与源自狂犬病毒 (RABV) 糖蛋白 (G) 的跨膜茎锚序列相连的球状 RBD。编码微刺突蛋白的水泡性口炎病毒 (VSV) 和 RABV 复制子不仅允许抗原在细胞表面表达，还可以将其整合到分泌的非感染性颗粒的包膜中，从而将经典的载体驱动抗原表达和颗粒状病毒样颗粒 (VLP) 呈递结合在一起。单剂量原型复制子疫苗 VSVΔG-minispike-eGFP (G) 刺激小鼠产生高滴度的 SARS-CoV-2 中和抗体，相当于 COVID-19 患者体内的抗体滴度。使用相同复制子进行加强免疫可进一步增强中和活性。这些结果表明，弹状病毒微刺突蛋白复制子是使用具有复制能力的病毒和/或整个 S 抗原的疫苗接种方法的有效且安全的替代方案。
使用有或没有双子病毒复制子的Cas9在大麦中靶向靶向
在过去几年中，在植物中使用基于RNA的CAS9基因组编辑的进展一直很快。基因组编辑的理想应用是基因靶向（GT），因为它允许广泛的精确修饰。但是，这仍然是不具备的，尤其是在关键农作物中。在这里，我们使用Planta策略描述了CAS9目标位置的成功，可遗传的基因靶向，但使用小麦矮人病毒复制品未能实现相同的方法，以增加维修模板的拷贝数。没有复制子，我们能够删除目标基因的150 bp的编码顺序，同时将框架内麦克利融合在一起。从14种原始转基因植物开始，两家植物似乎具有所需的基因靶向事件。从其中一种T0植物中，确定了三个独立的基因靶向事件，其中两个是可遗传的。当包括复制子时，产生了39种T0植物，并显示为修复模板的高拷贝数。然而，尽管与非修复策略相比，T1筛选的17条线没有引起显着或可遗传的基因靶向事件。调查表明，复制子方法创建的高拷贝数量的高拷贝数导致假阳性PCR结果，在序列水平上与GT研究广泛使用的连接PCR屏幕中的真实GT事件无法区分。在成功的非修复方法中，在T1中获得了可遗传基因靶向事件，随后，发现T-DNA与靶向基因座有关。因此，靶标和供体位点的物理接近可能是成功基因靶向的一个因素。
复制子 RNA 疫苗可在中和抗体减弱后在非人类灵长类动物中诱导针对 SARS-CoV-2 的持久保护性免疫
1 美国华盛顿州西雅图华盛顿大学微生物学系，2 美国华盛顿州西雅图华盛顿大学华盛顿国家灵长类动物研究中心，3 美国蒙大拿州汉密尔顿市美国国立卫生研究院落基山实验室国家过敏和传染病研究所内部研究部病毒学实验室，4 美国蒙大拿州汉密尔顿市美国国立卫生研究院落基山实验室国家过敏和传染病研究所内部研究部落基山兽医分部，5 美国华盛顿州西雅图弗雷德哈钦森癌症研究中心疫苗和传染病部，6 美国华盛顿州西雅图 HDT Bio，7 美国华盛顿大学生物化学系
病毒和流行病的性质：冠状病毒
冠状病毒 (CoV) 是 RNA 病毒中基因组最大的病毒，在细胞质中复制时无需整合基因组即可存储大量信息。病毒的复制是一个连续的过程，而亚基因组 mRNA 的转录是一个不连续的过程，涉及模板转换，这类似于高频重组机制，可能有利于病毒基因组的变异。三种致命的人类冠状病毒 SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 的起源是人畜共患事件。SARS-CoV-2 在其刺突蛋白中整合了一个呋喃蛋白酶水解位点，这有助于病毒在任何组织中被激活，使这种冠状病毒株具有高度的多变性和致病性。以 MERS-CoV 为模型，通过去除 E 蛋白基因（病毒形态形成所必需的基因，与毒力有关）和附属基因 3、4a、4b 和 5（负责拮抗先天免疫反应）来减毒病毒，从而生成了增殖缺陷型 RNA 复制子：MERS-CoV- Δ [3、4a、4b、5、E]。这种 RNA 复制子被强烈减毒，在用 MERS-CoV 受体转基因小鼠进行一次免疫后即可产生杀菌保护，使其成为该病毒的有希望的疫苗候选物，也是基于载体的疫苗开发的有趣平台。可以制定一种策略来设计针对其他人类致病冠状病毒的 RNA 复制子疫苗。
为 Hever 集团研发主管准备的调查...
• 非病毒递送的mRNA 目前，已开发两种形式的mRNA疫苗：常规mRNA疫苗和自扩增mRNA疫苗，后者源自正链RNA病毒。纯化的RNA复制子以合成配制的RNA递送到宿主细胞后，会通过其编码的RNA依赖性RNA聚合酶进行大量翻译和扩增。与常规mRNA的快速表达相比，已发表的结果表明，接种自扩增mRNA疫苗可导致更高的抗原表达水平，尽管时间有所延迟，但可在体内持续数天。虽然RNA剂量要低得多，但可提供同等的保护。由于缺乏病毒结构蛋白，复制子不会产生传染性病毒颗粒。此外，常规mRNA和自扩增mRNA
利用病毒复制子进行全基因组 CRISPR 敲除筛选，以鉴定参与病毒复制的宿主因子
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2025 年 1 月 11 日发布。；https://doi.org/10.1101/2025.01.09.632058 doi：bioRxiv 预印本
标题编程的IFN-γ的α病毒超出了巨噬细胞对溶瘤病毒疗法的不利影响。
与肿瘤相关的巨噬细胞摄取的病毒摄取可能会显着降低癌细胞感染的溶瘤病毒的可用性，并限制治疗功效。通过计算模型，我们假设编码诸如IFN-γ之类的T细胞刺激信号的溶瘤病毒都可以增强功效，而与巨噬细胞无关。为了测试这一点，我们设计了一个基于α病毒的复制子，表达IFN-γ，并研究了其在各种肿瘤免疫共培养系统中的作用。虽然α病毒复制子在巨噬细胞中不复制，但巨噬细胞很容易吸收病毒，以频率依赖性但非表型独立的方式限制肿瘤感染。然而，病毒摄取激活促炎反应，通过表达病毒编码的IFN-γ的相邻癌细胞进一步增强。因此，即使被感染的肿瘤细胞表达IFN-γ，无论巨噬细胞的存在，频率或表型如何，也可以确保T细胞激活。这些发现提出了一种通过设计可以刺激T细胞激活的病毒来优化高巨噬细胞浸润的肿瘤病毒疗法的策略，从而确保了治疗功效。
开发模块化双生病毒载体以实现植物的高表达和基因靶向
* 通讯地址：电话：919-515-5729；电子邮件：jmalonso@ncsu.edu 摘要 病毒载体可以成为表达重组蛋白以及递送基因编辑机制的有用工具。尽管它们很有用，但这些工具的开发和后续优化通常是一个困难而繁琐的过程。因此，尽管已经做了大量工作来创建用于基因编辑和蛋白质表达的有用病毒载体，但对于如何最好地设计这些载体以用于特定应用，人们缺乏了解。例如，通常不清楚加入异源启动子序列或不同的病毒成分是否会改善货物表达或复制子积累。为了解决其中一些障碍，我们设计了一种基于双生病毒 - 甜菜卷叶病毒 (BCTV) 的 GoldenBraid (GB) 兼容病毒载体系统。该系统允许对各种报告构建体进行简单的模块化克隆。利用这种模块化克隆策略，我们比较了各种替代病毒载体架构。有趣的是，天然 BCTV 启动子的表现优于组成型 35S 启动子，而 BCTV 病毒体正义基因的去除则促进了报告基因的表达。有趣的是，这些修改对总复制子积累没有影响。这些结果表明了新的模块化基于 BCTV 的病毒载体在蛋白质表达和基因靶向应用方面的实用性，同时也揭示了可能为未来基于双生病毒的病毒载体架构提供信息的设计原则。我们预计，这种新模块化系统的推出将引发基于复制子的策略在植物蛋白质表达和基因编辑实验中的广泛应用。关键词：病毒载体、基因编辑、甜菜曲顶病毒、双生病毒、GoldenBraid、瞬时表达。简介病毒载体已被证明可用于各种生物技术应用，例如基因组编辑和蛋白质表达。基于双生病毒的病毒载体已用于递送基因组编辑酶，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 Cas9，以及用于同源定向修复 (HDR) 的修复模板 (RT) (Butler 等人，2016 年；Wang 等人，2017 年；Yu 等人，2020 年；Gil-Humanes 等人，2017 年；Dahan-Meir 等人，2018 年，Eini 等人，2022 年)。