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基于 CRISPR-Cas13d 的有效抗病毒策略可对抗 SARS-CoV-2
摘要：当前的 SARS-CoV-2 大流行对全球健康造成了重大负担。尽管有保护性疫苗可用，但随着新的病毒变种不断出现，人们的担忧仍然存在。基于 CRISPR 的基因编辑方法提供了一种有吸引力的治疗策略，因为 CRISPR-RNA (crRNA) 可以快速调整以适应新的病毒基因组序列。本研究旨在利用 RNA 靶向 CRISPR-Cas13d 系统攻击病毒 RNA 基因组中高度保守的序列，从而为未来其他冠状病毒的人畜共患疫情做好准备。我们设计了 29 个 crRNA，以靶向整个 SARS-CoV-2 基因组中高度保守的序列。几种 crRNA 显示出有效沉默具有匹配病毒靶序列的报告基因并有效抑制 SARS-CoV-2 复制子。抑制 SARS-CoV-2 的 crRNA 也能够抑制 SARS-CoV，从而证明了这种抗病毒策略的广度。令人惊讶的是，我们观察到，只有针对正基因组 RNA 的 crRNA 在复制子测定中表现出抗病毒活性，而那些结合负基因组 RNA（复制中间体）的 crRNA 则相反。这些结果表明 SARS-CoV-2 基因组的 +RNA 链与 − RNA 链在脆弱性和生物学方面存在重大差异，并为 RNA 靶向抗病毒药物的设计提供了重要见解。
原核生物和真核生物中的DNA复制
DNA的复制始于在称为复制起源的位点放松双螺旋。在这些位点，碱基之间的氢键被损坏，并且成对底座分开。一对复制片段聚集在一起并连接非复制DNA的位置称为复制叉。在细菌染色体中，DNA复制总是从称为原点的特定位点开始。每个来源控制一个称为复制子的DNA单元的复制。细菌具有复制的单个特定起源
来自Saboba区和Bolgatanga Municipality Ghana的食源沙门氏菌和大肠杆菌的基因组表征
肠道沙门氏菌和大肠杆菌是与人类和动物中食源性疾病有关的众所周知的细菌。为它们的进化，毒力因素和抗药性确定提供了宝贵的见解。这项研究旨在表征先前分离的沙门氏菌（n = 14）和e。大肠杆菌（n = 19），使用全基因组测序中的牛奶，肉及其相关的餐具。在加纳，大多数沙门氏菌血清射手（弗雷斯诺，普利茅斯，iftantis，fivantis，give和orle-ans）在加纳尚待报道。大多数沙门氏菌分离株都是泛敏感的，但是赋予fosfomycin的抗性的基因（Fosa7。2）和四环素（TET（a））分别在一个和三个分离株中检测到。七个沙门氏菌分离株带有INCI1-I（Gamma）质粒复制子。尽管在沙门氏菌菌株中抗菌抗性并不常见，但大多数（11/19）E。大肠杆菌菌株至少具有一个分辨率基因，近一半（8/19）具有多药耐药性和携带质粒。19 e中的三个。大肠杆菌菌株属于通常与肠道e e相关的血清。大肠杆菌（EAEC）病原体。虽然属于毒力相关谱系的菌株缺乏关键质粒编码的毒力质粒，但在大多数E中都检测到了几种质粒复制子。大肠杆菌（14/19）菌株。被这些病原体污染的食物可以作为疾病传播的工具，带来严重的公共卫生风险，并需要严格的食品安全和卫生习惯，以防止爆发。因此，需要进行持续的监视和预防措施，以阻止食源性病原体的传播并降低加纳相关疾病的风险。
利用 RNA 病毒载体对植物基因组进行可遗传的 CRISPR-Cas9 编辑
病毒感染的系统性传播促进了编辑成分在植物组织内的积累。这导致了高效和快速的基因组编辑，从而为评估单向导 RNA (sgRNA) 设计的有效性和特异性提供了理想的筛选工具。几种基于植物 RNA 病毒的复制子已成功用于在组成性表达 Cas9 核酸酶的转基因植物中传递 sgRNA。9–19 然而，每种病毒载体都有自己的分子生物学特性，并且仅限于特定的宿主范围。在这里，我们描述了两种源自马铃薯病毒 X (PVX；Potexvirus 属) 和烟草脆裂病毒 (TRV；Tobravirus 属) 的病毒载体的工程改造，用于在模型物种本氏烟中传递非间隔 sgRNA（图 1）。所提出的 PVX 系统由单个二元载体 pLX-PVX 组成，该载体包含 PVX 基因组序列和一个来自竹花叶病毒 (BaMV) 的异源亚基因组启动子以驱动插入表达 (图 2)。TRV 系统依赖于 pLX-TRV1 和 pLX-TRV2，这是两个具有兼容来源的 T-DNA 载体，可同时进行病毒基因组成分的农杆菌接种 (JoinTRV)。pLX-TRV1 提供复制酶功能，而 pLX-TRV2 包含一个工程化的 TRV RNA2 序列和一个来自豌豆早褐病毒 (PEBV) 的异源亚基因组启动子以驱动插入表达 (图 2)。这两个病毒系统均基于 pLX 系列的紧凑 T-DNA 二元载体20，这些载体已成功用于通过农杆菌介导的接种 (农杆菌接种) 启动 RNA 和 DNA 病毒感染。 21–23 重组病毒复制子与 sgRNA 构建体组装并通过农杆菌接种递送到表达 Cas9 的植物中。系统性病毒感染导致生殖系基因组编辑和编辑后代的恢复（图 1）。
单剂量复制型 RNA 疫苗可在非人类灵长类动物中诱导产生针对 SARS-CoV-2 的中和抗体
图 1. 体外 repRNA-CoV2S 表征。（A）密码子优化的全长刺突 (S) 开放阅读框，包括 S1-、S2-、跨膜 (TM) 和胞质 (CD) 结构域，对应于 SARS-CoV-2 分离株武汉-Hu-1（GenBank：MN908947.3）中的位置 21,536 至 25,384，与 c 端 v5 表位标签融合，克隆到编码委内瑞拉马脑炎病毒株 TC-83 的 4 个非结构蛋白 (nsP1-4) 基因的 α病毒复制子中。 RNA 转录和加帽后，将 repRNA-COV2S 转染到 BHK 细胞中，24 小时后，使用 (B) 抗 v5 免疫荧光和 (C) 蛋白质印迹法分析细胞，使用恢复期人血清或抗 v5 进行免疫检测。重组 SARS-CoV2 刺突蛋白 (rCoV2-Spike) 和 repRNA-GFP 分别用作阳性和阴性对照。B 和 C 中的数据代表 2 个独立实验。57
功能多样性对哥斯达黎加可可农林系统中生态系统服务的影响
结果：PCR和整个基因组分析证实了MCR-1基因在10个大肠杆菌分离株中的存在。colistin的最小抑制浓度范围为4 ug/ml至32 ug/ml。分解分析表明，存在多种耐药性决定因素，赋予β-内酰胺，氨基糖苷，甲氧苄胺，磺胺酰胺，四环素，四环素，喹诺酮类，氟烯甲苯甲酸和大乙二醇化的多种耐药性决定因素。杂交基因组组装表明MCR-1在INCI2质粒上携带。质粒复制子键入表明INCI2型质粒（n = 10）是这些菌株中最普遍的质粒，其次是Incfib（n = 8），Incfic（n = 7），Incfia（n = 6），INCFII（incfii（incfii（incfii）（4），INCQ1（n = 3），INCQ1（n = 3），INCI1（N = 1），IN = 1），IN = 1（n = 1），IN = 1（n = 1），IN = 1（n = 1），（n = 1），（n = 1），（n = 1），（n = 1），（n = 1）（n = 1），（n = 1）（n = 1），（n = 1）。Achtman MLST打字方案在MCR -1阳性大肠杆菌中揭示了STS的大量多样性。毒力芬德分析表明，存在范围为4到19的许多毒力因子。
第 28 届国际抗病毒研究会议（ICAR...
丙型肝炎病毒 (HCV) 是黄病毒科中的单链 (ss) RNA 丙型肝炎病毒。目前的 HCV 治疗存在持续病毒应答率不足、耐药性快速出现等问题，特别是对于感染基因型 1 HCV 的患者。（1,2）我们合成了新的吡唑酰胺衍生物 (3) 作为抗丙型肝炎病毒药物，并研究了抑制机制（图 1）。活性最高的化合物抑制 Huh 5-2 细胞中的亚基因组 HCV 复制子 1b，EC50 为 6.7 μM，对 HCV 1b 的选择性指数为 23。命中化合物 1 不靶向 HCV NS5B 或 HCV IRES 介导的翻译；对 1 的抗 HCV 活性机制的评估表明，它抑制了 HCV 诱导的 COX-2 mRNA 和蛋白质表达，在 COX-2 启动子连接的荧光素酶报告基因检测中的 IC50 为 3.2 μM。我们的数据表明，吡唑酰胺衍生物通过在转录和翻译水平上靶向 COX-2 而充当抗 HCV 药物。这些结果为这种新型化学类 HCV 抑制剂的命中优化提供了强有力的基础。（1）Tan, SL, Pause, A. 等人。Nat. Rev. Drug. Disc. 2002, 1, 867-881。（2）Barreca, ML, Manfroni, G. 等人。J. Med. Chem. 2013, 56, 2270-2282。（3）Manvar, D., Pelliccia, S. 等人。Eur. J. Med. Chem. 2015，90，497-506
Exploring CRISPR-Cas9
CRISPR（成簇的规律间隔短回文重复序列）的发现彻底改变了我们对遗传机制的理解。1987 年，CRISPR 在大肠杆菌中被发现，其独特的结构（29 个核苷酸重复片段与 32 个核苷酸可变序列交错）激发了研究人员的想象力。随着研究的深入，科学家发现了多种短重复回文序列，长度从 24 到 40 个核苷酸不等，并被 20 到 58 个核苷酸的可变序列所划分。最初人们认为它有助于 DNA 修复和复制子分离，2005 年的一项里程碑式发现表明，重复元件之间的许多序列来自噬菌体和质粒——细菌和古细菌基因组的入侵者。这一发现将 CRISPR 重新定义为能够识别和对抗外来遗传物质的原核免疫系统。 CRISPR/Cas9 系统通过利用高精度核酸酶在特定基因组位置诱导双链断裂，彻底改变了基因编辑。然后通过易错非同源末端连接 (NHEJ) 或无错同源定向修复 (HDR) 等细胞过程修复这些断裂，从而实现精确的基因修饰。此类定向编辑为遗传疾病提供了潜在的治疗方法，并有望用于修饰植物、动物甚至昆虫。由 CRISPR 推动的基因探索时代为生物学进步开辟了前所未有的机遇。在我们探索这一新领域时，必须负责任地使用这些强大的工具，在考虑其伦理影响的同时，接受它们提供的深远可能性。
CRISPR/Cas 基因组编辑在番茄改良中的应用
番茄的遗传基础狭窄，给育种带来了严峻挑战。因此，随着成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 基因组编辑的出现，快速高效的番茄育种已成为可能。番茄的许多性状已使用 CRISPR/Cas9 进行编辑和功能表征，例如植物结构和花的特性（例如叶、茎、花、雄性不育、果实、单性结实）、果实成熟、品质和营养（例如番茄红素、类胡萝卜素、GABA、TSS、花青素、保质期）、抗病性（例如 TYLCV、白粉病、晚疫病）、非生物胁迫耐受性（例如热、旱、盐度）、CN 代谢和除草剂抗性。CRISPR/Cas9 已被证明可用于将野生近缘种的优良性状从头驯化到栽培番茄，反之亦然。 CRISPR/Cas 的创新允许使用在线工具进行单向导 RNA 设计和多路复用、克隆（例如 Golden Gate 克隆、GoldenBraid 和 BioBrick 技术）、强大的 CRISPR/Cas 构建体、高效的转化方案（例如农杆菌）和用于 Cas9-gRNAs 核糖核蛋白 (RNPs) 复合物的无 DNA 原生质体方法、Cas9 变体（例如无 PAM 的 Cas12a 和 Cas9-NG/XNG-Cas9）、基于同源重组 (HR) 的双生病毒复制子基因敲入 (HKI) 以及碱基/引物编辑（Target-AID 技术）。这篇小型评论重点介绍了 CRISPR/Cas 在番茄快速高效育种方面的最新研究进展。