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大肠杆菌亮氨酸响应调节蛋白在体内桥接 DNA，并在外源亮氨酸存在下可调地解离
摘要 盛宴-饥荒反应蛋白是原核生物中一类广泛保守的全局调节蛋白，其中研究最多的是大肠杆菌亮氨酸反应调节蛋白 (Lrp)。Lrp 能够感知环境营养状况，并随后直接或间接地调节大肠杆菌中多达三分之一的基因。Lrp 主要以八聚体和十六聚体 (16 聚体) 的形式存在，其中亮氨酸被认为会使平衡向八聚体状态移动。在本研究中，我们分析了三种寡聚状态的 Lrp 突变体在其与 DNA 结合和调节外源亮氨酸引起的基因表达的能力方面的影响。我们发现二聚体以上的寡聚化是 Lrp 的调节活性所必需的，并且与之前的推测相反，外源亮氨酸仅通过抑制 Lrp 与 DNA 结合来调节其靶启动子处的 Lrp 活性。我们还证明了 Lrp 结合可以在数千碱基的长度范围内连接 DNA，揭示了 Lrp 介导的转录调控的一系列新机制。
外源 β-葡萄糖苷酶的靶向整合增强了纤维素梭菌中的纤维素降解和乙醇生产
细菌 Clostridium cellulolyticum 是整合生物加工 (CBP) 的有希望的候选者。然而，需要进行基因工程来提高这种生物的纤维素降解和生物转化效率，以满足标准的工业要求。在本研究中，CRISPR-Cas9n 用于将高效的 β -葡萄糖苷酶整合到 C. cellulolyticum 的基因组中，破坏乳酸脱氢酶 ( ldh ) 表达并降低乳酸产量。与野生型相比，工程菌株的 β -葡萄糖苷酶活性增加了 7.4 倍，ldh 表达减少了 70%，纤维素降解增加了 12%，乙醇产量增加了 32%。此外，ldh 被确定为异源表达的潜在位点。这些结果表明，同时进行 β -葡萄糖苷酶整合和乳酸脱氢酶破坏是提高 C. cellulolyticum 中纤维素到乙醇的生物转化率的有效策略。
时间和剂量依赖性的播种趋势在细胞中的外源性tau R2和R3聚集体
tauopathies是一组神经退行性疾病，分为三种类型，分为3R，4R或3RÞ4R（混合）tauopathies，基于构成异常含量的TAU同工型。据认为所有六个TAU同工型具有功能特征。然而，与不同的呼吸病相关的神经病理病理学的差异提供了一种可能性，疾病的进展和tau的积累可能会因同工型组成而有所不同。微管结合结构域中的重复2（r2）定义了同工型的类型，这可能会影响与特定TAU同工型相关的TAU病理学。因此，我们的研究旨在确定使用HEK293T生物传感器细胞的R2和重复3（R3）聚集体的差异差异。我们表明，由R2诱导的播种通常高于R3聚集体，较低浓度的R2聚集体能够诱导播种。接下来，我们发现R2和R3聚集物均剂量依赖性地增加了Triton-溶于剂的Ser262天然Tau的磷酸化，尽管在较高浓度（12.5 nm或100 nm）的R2和R3聚集体的细胞中，该细胞在较高的R2聚集物中播种，但在72小时的浓度下，R2和R3聚集体可见。然而，在用R2诱导的细胞中可见Triton-不溶pser262 tau的积累比R3聚集体中可见。我们的发现表明R2区域可能有助于早期和增强tau聚集的诱导，并定义4R tauopathies疾病进展和神经病理学的差异。©2023 Elsevier Inc.保留所有权利。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
高效无外源DNA Cas9的优化
面对人口快速增长、气候变化和疾病，精准工程对作物性状改良的进步至关重要。为此，使用 RNA 引导的 Cas9 的靶向双链断裂技术已被广泛用于植物基因组编辑。通过农杆菌或粒子轰击递送编码 Cas9 和向导 RNA (gRNA) 的质粒很常见，但需要优化表达，并且通常会导致质粒 DNA 随机整合到植物基因组中。最近的进展描述了通过将 Cas9 和 gRNA 作为预组装的核糖核蛋白 (RNP) 递送到各种植物组织中进行基因编辑，但在产生再生植物方面效率中等。在本报告中，我们描述了小麦中 Cas9-RNP 介导基因编辑的重大改进。我们证明，原生质体中的 Cas9-RNP 检测是一种快速有效的工具，可用于合理选择可再生未成熟胚胎 (IE) 中用于基因编辑的最佳 gRNA，并且高温处理可提高两种组织类型的基因编辑率。我们还表明，在金粒子轰击的小麦 IE 中，Cas9 介导的编辑至少持续 14 天。本研究中再生的编辑小麦植株在没有外源 DNA 和选择的情况下以高比率恢复。通过这种方法，我们敲除了一组三个同源基因和两个致病效应易感基因，从而设计出对相应基因的不敏感性
外源 DNA 序列的“同类相食”：适应性免疫的祖先形式，需要识别危险
适应性免疫是一种复杂的免疫反应形式，能够保留大量靶抗原（表位）作为非自身抗原的分子记忆。当它再次遇到具有已知表位的免疫球蛋白或 T 细胞受体抗原结合位点时，它能够重新激活自身，而这些表位之前曾激活过宿主免疫系统。长期以来，人们一直认为适应性免疫是一种高度进化的非自身识别形式，在物种形成过程中出现得相当晚，是对一种更普遍的反应（称为先天免疫）的补充。先天免疫提供了一种相对非特异性的防御（尽管由能够特异性识别病毒或细菌化合物的传感器介导），并且不保留对危险的记忆。但是，这种最近获得适应性免疫的概念受到了挑战，因为原核生物中已经存在另一种形式的特定识别机制，这种机制可能能够特异性地自动防御外部危险。这种识别机制可以被认为是一种原始形式的特定（适应性）非自身识别。它基于这样一个事实：许多古细菌和细菌使用一种基因组编辑系统，该系统赋予原核生物适当的病毒 DNA 序列的能力，使它们能够通过一种与适应性免疫非常相似的机制来防止宿主受到损害。这被模糊地称为“外来 DNA 的内源化”或“病毒 DNA 捕食”，或者更形象地说是“DNA 同类相食”。多年来，证据不断积累，突显了外来 DNA 的内源化在与适应性免疫相关的基本过程中的关键作用，并导致了适应性免疫在物种形成后期出现的教条的改变。
利用 CRISPR-Cas9 同时进行 HDR 过表达和 NHEJ 抑制，在杨树中进行精确的外源插入和序列替换
CRISPR 介导的基因组编辑已成为生物性状遗传修饰的有力工具。然而，开发基于同源定向 DNA 修复 (HDR) 的高效、位点特异性基因敲入系统仍然是植物面临的重大挑战，尤其是在杨树等木本植物中。本文表明，同时抑制非同源末端连接 (NHEJ) 重组辅因子 XRCC4 和过度表达 HDR 增强因子 CtIP 和 MRE11 可以提高基因敲入的 HDR 效率。使用这种方法，BleoR 基因被整合到 MKK2 MAP 激酶基因的 3' 端以产生 BleoR-MKK2 融合蛋白。根据 TaqMan 实时 PCR 评估的完全编辑核苷酸，与没有 HDR 增强或 NHEJ 沉默相比，当使用 XRCC4 沉默结合 CtIP 和 MRE11 过度表达时，HDR 介导的敲入效率高达 48%。此外，HDR 增强子过表达和 NHEJ 抑制的组合还提高了基因组靶向效率，使 CRISPR 诱导的插入和缺失 (InDels) 减少了 7 倍，从而对杨树中基于 MKK2 的盐胁迫反应没有功能性影响。因此，这种方法不仅适用于杨树和植物或农作物，也适用于哺乳动物，以提高 CRISPR 介导的基因敲入效率。
招募内源性和外源性ADAR酶进行位点特异性RNA编辑的方法
作用于 RNA 的腺苷脱氨酶 (ADAR) 可以重新用于实现位点特异性的 A-to-I RNA 编辑，方法是通过 ADAR 招募向导 RNA (adRNA) 将它们招募到感兴趣的靶标上。在本章中，我们详细介绍了通过两种正交策略实现此目的的实验方法：一是通过招募内源性 ADAR（即已经在细胞中天然表达的 ADAR）；二是通过招募外源性 ADAR（即将 ADAR 递送到细胞中）。对于前者，我们描述了使用环状 adRNA 将内源性 ADAR 招募到所需的 mRNA 靶标上。这可在体外和体内实现稳健、持久且高度转录特异性的编辑。对于后者，我们描述了使用 split-ADAR2 系统，该系统允许过度表达 ADAR2 变体，可用于以高特异性编辑腺苷，包括难以编辑非优选基序中的腺苷，例如 5′ 鸟苷两侧的腺苷。我们预计所述方法应促进研究和生物技术环境中的 RNA 编辑应用。
外源IL-4和IL-10提高了原发性...
6。Purpose of this study .................................................................................................................... 27 6.1 Rationale ............................................................................................................................................... 27 6.2 Hypothesis ............................................................................................................................................ 29 6.3项目目标................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 29
评论文章工程蛋白质开关，用于外源控制基因表达
合成生物学界对调节基因表达的新方法存在持续的需求。蛋白质开关感知生物学输入并以功能输出响应，代表了满足这种需求的一种方法。尽管已经有大量的转录因子和信号传导蛋白可用，但现有开关的库缺乏某些应用所需的基板特异性和活动。因此，已经将大量技术应用于具有新颖性能的工程师开关。在这里，我们通过将它们广泛地组织为三种方法来讨论其中一些技术。我们展示了如何通过诱变，域交换或域插入来创建新颖的开关。然后，我们将其贴上来讨论它们作为生物剂和复杂遗传回路的用途。