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简单、高效、开源的 CRISPR/Cas9 策略用于欧洲山杨多位点基因组编辑
尽管 CRISPR/Cas9 系统已成功用于作物育种，但其在林木中的应用仍然有限。本文，我们描述了一种基于 Golden Gate MoClo 克隆的杂交杨树（Populus tremula × alba INRA 克隆 717-1B4）的有效基因编辑策略。为了测试系统生成单基因突变体的效率，设计了两个单向导 RNA (sgRNA)，并将其与 Cas9 表达盒一起整合到 MoClo Tool Kit 2 级二元载体中，以突变 SHORT ROOT (SHR) 基因。此外，我们还通过表达一个针对 YUC4 基因单个位点的 sgRNA 和另一个针对 PLT1 基因的 sgRNA 来测试其同时在两个基因中引入突变的效率。为了对该方法进行稳健评估，我们重复了该策略，使用独立的构建体同时靶向 LBD12 和 LBD4 基因。我们通过农杆菌介导的叶片转化产生了毛状根。测序结果证实了 PtaSHR 靶位点发生了 CRISPR/Cas9 介导的突变。检测到了双等位基因和纯合敲除突变。跨越两个靶位点的缺失和小插入/缺失是最常见的突变。在测序的 22 个 SHR 等位基因中，有 21 个发生了突变。表型表征表明，具有 SHR 基因双等位基因突变的转基因根缺乏明确的内胚层单细胞层，表明其基因功能保守，类似于拟南芥 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh 中的同源物。测序结果还揭示了该系统产生双突变体的高效性。在评估的四个转基因根中，有三个 ( yuc4/plt1 ) 和两个 ( lbd12/lbd4 ) 检测到了 yuc4/plt1 和 lbd12/lbd4 根中两个基因的双等位基因突变。最常见的突变是单个靶位点的小片段缺失或单个核苷酸插入。这种 CRISPR/Cas9 策略是一种快速、简单且标准化的基因编辑工具，可用于评估基因在杨树根部径向细胞分化等重要发育程序中的作用。
通过热诱导 ssDNA 重组技术对假单胞菌进行高效多位点基因组编辑
单链 DNA 重组工程在肠道细菌以外物种的基因组编辑中的应用受到重组酶效率和内源性错配修复 (MMR) 系统作用的限制。在这项工作中，我们建立了一个遗传系统，用于在生物技术相关菌株 EM42 的染色体中输入多种变化。为此，设计了 PL / c I857 系统的控制下，rec2 重组酶和 P. putida 的等位基因 mutL E36K PP 的高水平热诱导共转录。短时间热转移循环，然后用一套诱变寡核苷酸进行转化，可产生不同类型的基因组变化，每次修饰的频率高达 10%。相同的方法有助于超级多样化短染色体部分，以创建功能性基因组片段文库——例如核糖体结合位点。这些结果使得假单胞菌基因组工程的多重化成为可能，这是这种重要合成生物学底盘代谢重编程所必需的。