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肽抑制剂和荧光探针，用于选择性抑制和标记第XIIIA转谷氨酰胺酶
摘要：第XIIIA（FXIIIA）是一种主要治疗兴趣的转谷氨酰胺酶，这是由于其在血液凝结级联反应中的重要作用而发展抗凝剂。虽然已经报道了许多FXIIIA抑制剂，但由于缺乏代谢稳定性和对转谷氨酰胺酶2（TG2）的选择性低，因此未能达到临床评估。此外，用于研究FXIIIA活性和定位的化学工具非常有限。为了消除这些缺点，我们设计，合成和评估了21个新型FXIIIA抑制剂的库。亲电战争头，接头长度和疏水单位在小分子和肽支架上有所不同，以优化同工酶的选择性和效力。然后，将先前报道的FXIIIA抑制剂改编成具有若丹明B部分的探针设计，从而产生创新的KM93作为首次已知的溶液探针，旨在选择性地标记具有较高功能的活性FXIIIA（k Inact / k Inact / k I = 127,300 m-1-1-1-5-5-5）。探针KM93在骨髓巨噬细胞中促进了荧光显微镜研究，在细胞培养中标记具有较高效率和选择性的FXIIIA。这些新型抑制剂和探针的结构 - 活动趋势将有助于对活动，抑制和定位FXIIA的未来研究。
17K17879研究结果报告
因此，我们旨在通过反复进行目标AID的基本构建以及对反馈的评估和验证，以建立高度的技术。 （1）基本技术的构建：首先创建超级目标AID，为了使基因组编辑更有效，我们将创建一个改进的功能目标AID（超级目标AID）。研究主要考虑质粒方面的变化。我们旨在通过使用没有复制能力的瞬态质粒来控制温度敏感启动子和组成启动子的DCAS9和CRISPR-GRNA，使用快速降解酶（LVATAG）[参考2]，以及使用抑制DNA修复机制（UGIS）的系统。接下来，我们还将考虑修改酶本身。我们还考虑使用反遗传方法的改进，例如减少CAS9非特异性结合的突变[参考3]，增加辅助酶活性的突变[参考4]以及对融合酶的接头长度的修改。 （2）评估基础替代效率：基因组编辑中靶点效应的验证，关键点是如何抑制与目标序列不同的位点的意外诱变，以及如何验证这一点。意外突变包括通过类似于目标序列的靶向序列引入的突变，以及完全独立于序列的非特异性突变。为了验证脱靶，使用破坏RPOB基因的利福平抗药性菌株进行评估。在改进目标基因，培养条件和目标AID的编辑方法的同时，进行了非目标评估，并最终进行了大肠杆菌的整个基因组序列以验证测试。