XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System核移植
细胞周期阶段和 DNA 修复途径影响猪胚胎中 CRISPR/Cas9 基因编辑效率
摘要：CRISPR/Cas9 技术是一种用于在不同细胞类型和物种中操作基因组的强大工具。然而，与所有新技术一样，它仍然需要改进。不同的因素会影响 CRISPR/Cas 在受精卵中的效率，从而影响创建大型动物研究模型的总成本和复杂性。本研究评估了 CRISPR/Cas9 成分注射时早期注射（激活/受精后 6 小时内）与晚期注射（激活/受精后 14-16 小时）受精卵细胞周期阶段的重要性，以及 DNA 修复的同源重组 (HR) 途径的抑制对受精、精子注射、体细胞核移植和孤雌激活技术产生的胚胎的基因编辑、胚胎存活和发育的影响。与早期注射（86.3%；28.8%）相比，晚期细胞周期注射降低了胚胎存活率（以未裂解胚胎的比例衡量）和囊胚形成率（68.2%；19.3%）。然而，晚期注射（73.8%）的囊胚基因编辑率高于早期注射（63.8%）的囊胚。抑制 HR 修复通路可使早期注射的囊胚基因编辑效率提高 15.6%，而不会影响胚胎发育。我们的研究结果表明，在早期细胞周期注射以及 HR 抑制可提高猪囊胚的受精卵活力和基因编辑率。
利用基于 CRISPR/Cas9 的转录调控系统进行细胞重编程
多年来积累的有关细胞分化机制的数据推动了细胞重编程的发展——这是生物技术的一个全新策略。将体细胞恢复到多能状态甚至将一种体细胞类型直接转换为另一种体细胞类型（转分化）的能力已成为细胞生物学的一项重要突破，因为它广泛应用于从基础研究到再生医学和遗传疾病治疗。早期的重编程技术，如体细胞核移植 (SCNT) 和细胞融合，大约 60 年前首次实施，证实了体细胞的分化状态是可以逆转的（Briggs 和 King，1952 年；Köhler 和 Milstein，1975 年）。尽管这些技术适用于多种应用（Köhler 和 Milstein，1975 年；Lee 等人，2016 年），但对于大多数现代重编程目的而言，它们仍然过于随机和不可控。重编程的下一个级别是在体细胞中外源性过度表达转录因子 (TF)。Takahashi 和 Yamanaka (2006) 在他们著名的将体细胞重编程为诱导多能干细胞 (iPSC) 的实验中使用了这种方法。TF 的过度表达仍然是改变细胞命运的最常见和最有效的方法。如今，存在多种技术可以实现这种改变。其中之一可能是 CRISPR/Cas9 — 一种基于细菌抗病毒防御系统的基因工程工具（Hsu 等人，2014 年）。该系统经过多次修改，不仅允许 DNA 编辑，还可以通过激活、抑制甚至染色质重塑等不同方式调节基因表达。
CRISPR/Cas9 介导大转基因整合至猪 CEP112 基因座
摘要 成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关蛋白 9 (Cas9) 是一种精确的基因组操作工具，可在各种细胞和生物体中产生靶向基因突变。尽管 CRISPR/Cas9 可以有效地产生基因敲除，但同源定向修复介导的基因敲入 (KI) 效率仍然很低，尤其是对于大片段整合。在本研究中，我们建立了一种有效的方法，用于 CRISPR/Cas9 介导的大型转基因盒整合，该盒携带唾液腺表达的多种消化酶 (20 kbp) 在猪胎儿成纤维细胞 (PFF) 的 CEP112 基因座中。我们的结果表明，使用具有短臂和长臂的最佳同源供体在 CEP112 基因座中产生了最好的 CRISPR/Cas9 介导的 KI 效率，并且 CEP112 基因座的靶向效率高于 ROSA26 基因座。CEP112 KI 细胞系被用作核供体，进行体细胞核移植以创建转基因猪。我们发现 KI 猪 (705) 在唾液腺中成功表达三种微生物酶 (b-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶)。这一发现表明 CEP112 基因座通过组织特异性启动子支持外源基因表达。总之，我们利用我们的最佳同源臂系统成功地在猪体内靶向 CEP112 基因座，并建立了一种改良的猪唾液中表达外来消化酶的模型。
一种无需单克隆选择、快速高效生成精确编辑猪的非转基因方法
用于农业和生物医学应用的基因编辑猪通常使用体细胞核移植 (SCNT) 生成。然而，SCNT 需要使用单克隆细胞作为供体，而耗时费力的单克隆选择过程限制了大批基因编辑动物的生产。在这里，我们开发了一种快速有效的方法，称为 RE-DSRNP（报告 RNA 富集双 sgRNA/CRISPR-Cas9 核糖核蛋白），用于生成基因编辑供体细胞。 RE-DSRNP利用双sgRNA精准高效的编辑特点和报告RNA富集的RNP（CRISPR-Cas9核糖核蛋白）高编辑效率、低脱靶、无转基因、低细胞毒性的特点，无需筛选单克隆细胞，将供体细胞的生成时间从3-4周大大缩短至1周，同时也降低了供体细胞凋亡和染色体非整倍体的程度。我们应用RE-DSRNP技术生产了带有野生型p53诱导的磷酸酶1（WIP1）基因缺失编辑的克隆猪：在32头断奶克隆猪中，31头（97%）携带WIP1编辑，15头（47%）为设计片段缺失纯合，未检测到脱靶事件。 WIP1 基因敲除 (KO) 猪表现出雄性生殖障碍，这说明 RE-DSRNP 可用于快速生成精确编辑的动物，用于功能基因组学和疾病研究。RE-DSRNP 在大型动物中的强大编辑性能以及其显著缩短的 SCNT 供体细胞生成所需时间，为其在快速生成无转基因克隆动物种群中的应用前景提供了支持。
通过 RNA 测序分析揭示基因编辑荷斯坦牛角发育中 Pc 基因座的新特征
摘要：无角凯尔特（Pc）突变位点是一种遗传学上简单的单突变，是利用基因编辑技术培育无角牛的最佳选择。但Pc位点调控角芽发育的机制尚不明确，因此利用基因编辑、体细胞核移植和胚胎移植的方法获得无角荷斯坦胎牛（妊娠期90天），以纯合Pc插入的胎牛（基因编辑荷斯坦胎牛，EH）和野生型90天荷斯坦胎牛（WH）作为对照。苏木精-伊红（HE）染色结果显示，与WH相比，EH角芽没有白色角化突起或空泡状角质形成细胞，真皮组织下没有粗大的神经束。DNA测序结果显示，Pc位点以纯合方式插入胎牛基因组中。通过转录组测序分析共鉴定出791个差异表达基因。差异表达基因富集分析与蛋白相互作用分析结果显示，Pc插入后存在丰富的基因改变，与粘附分子调控、肌动蛋白表达、细胞骨架变形以及角蛋白表达与角化有关。同时值得注意的是，结果中还包含多个已报道与角性状发育相关的基因，如RXFP2、TWIST1等，本研究首次鉴定出这些改变并进行了总结。研究结果提示，Pc突变位点可能抑制神经嵴细胞EMT生成和角蛋白表达，导致神经嵴细胞不能迁移和角芽组织不能角化，从而调控无角表型的产生。
通过精准胚胎介导的基因组编辑生产浅色、低吸热的荷斯坦弗里斯牛
背景 . 基因组编辑能够在一代内将有益的序列变异引入具有高遗传价值的动物的基因组中。这可以通过将变异引入原代细胞，然后通过体细胞核移植克隆从这些细胞中产生活体动物来实现。后一步与效率低下和由于供体细胞错误重编程而导致的发育问题有关，从而引起动物福利问题。直接编辑受精的单细胞胚胎可以规避这个问题，并且可能更好地与行业实施的基因改良策略相结合。方法 . 体外受精的合子被注射 TALEN 编辑器和修复模板，以在 PMEL 基因中引入已知的毛色稀释突变。在将经过验证的胚胎转移到受体体内发育至足月之前，通过聚合酶链反应和测序筛选注射胚胎的胚胎活检样本以查找预期的双等位基因编辑。对小牛进行基因分型，并用可见光和高光谱相机扫描其皮毛以评估热能吸收情况。主要结果 . 生产了多头具有精确编辑基因型的非嵌合型小牛，包括来自高遗传价值父母的小牛。与对照组相比，经过编辑的小牛显示出明显的毛色稀释，这与较低的热能吸收率有关。 结论 . 虽然活检筛查并不绝对准确，但可以通过胚胎介导的编辑轻松生产出非嵌合型、精确编辑的小牛。 PMEL 突变导致的较浅的毛色可以降低辐射热增益，这可能有助于减少热应激。 意义 . 该研究验证了推定的致病序列变异，以使放牧牛快速适应不断变化的环境条件。
利用 CRISPR/Cas9 介导的靶向整合生成 Y 染色体中含有 EGFP 基因的转基因克隆水牛胚胎
性别控制技术在家畜生产中具有重要意义，尤其对于快速繁殖的水牛（bubalus bubalis）具有重要意义，本研究以水牛为研究模型。我们已证实整合到小鼠Y染色体上的荧光蛋白可用于小鼠植入前胚胎的性别鉴定。首先，我们优化了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和mCherry外源基因在Neuro-2a细胞、小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎细胞（NIH3T3）、水牛胎儿成纤维细胞（BFF）中的靶向整合效率。结果表明，靶标两侧同源臂长度为800 bp比300 bp或300 bp/800 bp更有效。当细胞补充了 pifithrin-µ（一种抑制 p53 与线粒体结合的小分子）时，BFF 细胞中同源定向修复 (HDR) 介导的敲入也得到了显著改善。250 V 的三个脉冲在 BFF 细胞中产生最有效的电穿孔，并且发现 1.5 µ g/mL 嘌呤霉素是筛选的最佳浓度。此外，利用 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑结合体细胞核移植 (SCNT) 技术成功生成了 Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞和克隆水牛胚胎。在第 6-8 代时，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞的生长率和细胞增殖率明显低于非转基因 BFF 细胞；甲基化相关基因 DNMT1 和 DNMT3a 的表达水平相似；然而，与非转基因细胞相比，Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 细胞中乙酰化相关基因 HDAC1 、 HDAC2 和 HDAC3 的表达水平显著较高（p < 0.05）。Y-Chr-eGFP 转基因 BFF 被用作 SCNT 的供体，结果表明 eGFP 报告基因适用于胚胎性别的可视化。克隆水牛胚胎的囊胚率相似；然而，与对照相比，转基因克隆胚胎的卵裂率明显较低。总之，我们优化了产生转基因 BFF 细胞的方案，并使用这些细胞作为供体成功产生了 Y-Chr-eGFP 转基因胚胎。
第 1 部分
第 1 条 制定动物遗传学评估规则和程序，对在农业和畜牧业部登记的精液采集和处理中心登记的牛、水牛、绵羊和山羊种畜的遗传质量进行分类。唯一款。本条款部分列出的规则和程序旨在促进国家畜群的遗传收益。第 2 条 为了精液商业化，对精液收集和处理中心的饲养者遗传质量进行分类时，必须遵守以下要求：I - 向农业和畜牧业部提交申请； II - 出示由农业和畜牧业部授权执行谱系登记服务的该品种的育种者协会颁发的最终谱系登记证书或最终谱系控制证书，或由在农业和畜牧业部注册的促进动物技术测试的实体颁发的特殊识别和生产证书； III - 通过 DNA 基因分型证明与父母的亲属关系资格，并提交由农业和畜牧业部认可的实验室进行的等位基因谱报告； IV - 针对每个品种或种族组成，提供一份证明其在公认的改良计划中进行了基因评估的文件。 §1º 为了遵守本条第三项，可以接受其他形式的亲属关系证明和等位基因谱，前提是它们事先得到农业和畜牧业部的批准。 § 2 本条第 IV 款中提到的文件必须是遗传改良计划提供的最新文件。第 3 条 育种者的动物遗传学评估将根据遗传改良计划的选择指数进行分类，并获得遗传分类印章，形式为本条例附件一。唯一款。为了宣传和推广精液收集和处理中心、协会、动物技术测试促进实体、饲养者等的精液和遗传物质的销售，必须在所有宣传材料中披露饲养者的动物遗传学评估的遗传分类，即：I - 金印 - 上次评估中排名前 10%（deca 1）的合格捐赠者。 II - 银印 - 上次评估中合格捐赠者比上次评估优秀 10% 至 30%（第 2 和第 3 年）。 III - 铜印 - 上次评估中合格捐赠者比上次评估优秀 30% 至 50%（第 4 和第 5 年）。 IV - 红印 - 低于平均水平的捐赠者，在上次评估中合格率在 50% 到 100% 以上（6 到 10 年）。 V - 白色印章 - 没有进行基因评估的捐赠者。§1º本条第一款所述的官方遗传分类印章的模型应符合以下要求：圆形，周围刻有“农业和畜牧业部”和“动物遗传评估”字样；内部包含中心突出显示的百分位数或十位数；并在下方写上“有效期至 dd/mm/yyyy”，按照附件一中示例的格式。§ 2 本条顶部提到的披露必须至少包含动物遗传学评估所依据的计划中的标识和分类、包含颜色的印章描述、百分位数或十进制数，以及动物遗传学评估的有效期。 § 3º 当饲养者要求对巴西尚未进行基因评估的品种进行动物遗传学评估时，根据第 2 条第 IV 款，这些动物将在本 IN 公布之日起最多 5（五）年内获得白印，此后必须遵守上述条款。第 4 条 持有特殊识别和生产证书、年龄为 5 岁或以上的动物必须提供由在农业和畜牧业部注册的动物技术测试促进实体颁发的补充和最新的基因评估信息以及这些动物的后代数据。第五条 农业和畜牧业部将发布补充法案，列出有害基因、单倍型和/或等位基因，旨在禁止携带这些基因的饲养者进入精液收集和处理中心，以减少此类等位基因在已鉴定品种/种族群体中的频率，造福国家畜牧业。第 6 条 本条例所规定的用于商业化目的的动物遗传学评估有效期为 2（两）年，在此期间，任何在农业和畜牧业部注册的精液收集和加工中心均可将其用于第 3 条所规定的分类目的。唯一款。该期限结束后，为了将精液库存商业化，精液收集和处理中心必须要求进行新的动物遗传学评估，以使动物的基因分类保持最新，如第 3 条所规定的那样。第 7 条精液收集和处理中心、育种者协会、动物技术测试推广实体和其他利益相关者必须在其网站、目录和广告材料上宣传本标准中建立的分类，以支持农业和畜牧业部的教育工作，目的是提高巴西养牛农民对参与基因改良计划和官方动物技术测试的重要性的认识，因为它们对农业综合企业有影响。第八条 必须符合本条例第二条第一款、第二款、第三款的规定，在精液采集和处理中心注册饲养员时，其具体目的是收集精液，用于后代测试或研究。 §1º 对于章程规定的登记，必须有负责基因改良计划的人员出具的声明，告知育种者被选中参加后代测试，以及测试所需的剂量。 §2 如有研究需求，研究项目必须提交农业和畜牧业部进行评估，其中至少包含项目技术负责人姓名、目标、方法、所涉及农场名单以及研究所需剂量数量等信息。 §3 签发的授权文件中必须注明为剂量所述目的而采集的剂量。第 9 条 对于本条例所涵盖的对来自核移植 (NT) 的饲养者的评估，只接受通过对动物本身或移植来源动物进行基因评估而提供的性能证明，前提是来自 NT 的动物尚未满 7 岁，并且基因评估基于后代的数据。第十条 饲养者在精液采集和处理中心进行注册，用于商业化精液，目的是维持或增加受到威胁或面临严重灭绝风险的遗传群体的有效规模，或渗入具有动物技术意义的等位基因，使用进口或非进口材料，这些材料没有证明系谱鉴定或遗传价值量化的文件，经农业和畜牧业部分析后可获得授权。唯一款。必须提供研究机构进行的遗传或基因组研究，前提是它不会引起相关人员之间的利益冲突，并且必须证明遗传物质对国家畜群的重要性。第十一条 饲养者向精液采集和处理中心登记，采集精液供其主人畜群专用，不受本条例第二条第四项的要求限制。第十二条 2020年3月3日第13号规范性指示现予废止。第十三条 本条例自公布之日起生效。至少包括项目技术负责人的姓名、目标、方法、所涉及农场的名单以及研究所需的剂量数量等信息。 §3 签发的授权文件中必须注明为剂量所述目的而采集的剂量。第 9 条 对于本条例所涵盖的对来自核移植 (NT) 的饲养者的评估，只接受通过对动物本身或移植来源动物进行基因评估而提供的性能证明，前提是来自 NT 的动物尚未满 7 岁，并且基因评估基于后代的数据。第十条 饲养者在精液采集和处理中心进行注册，用于商业化精液，目的是维持或增加受到威胁或面临严重灭绝风险的遗传群体的有效规模，或渗入具有动物技术意义的等位基因，使用进口或非进口材料，这些材料没有证明系谱鉴定或遗传价值量化的文件，经农业和畜牧业部分析后可获得授权。唯一款。必须提供研究机构进行的遗传或基因组研究，前提是它不会引起相关人员之间的利益冲突，并且必须证明遗传物质对国家畜群的重要性。第十一条 饲养者向精液采集和处理中心登记，采集精液供其主人畜群专用，不受本条例第二条第四项的要求限制。第十二条 2020年3月3日第13号规范性指示现予废止。第十三条 本条例自公布之日起生效。至少包括项目技术负责人的姓名、目标、方法、所涉及农场的名单以及研究所需的剂量数量等信息。 §3 签发的授权文件中必须注明为剂量所述目的而采集的剂量。第 9 条 对于本条例所涵盖的对来自核移植 (NT) 的饲养者的评估，只接受通过对动物本身或移植来源动物进行基因评估而提供的性能证明，前提是来自 NT 的动物尚未满 7 岁，并且基因评估基于后代的数据。第十条 饲养者在精液采集和处理中心进行注册，用于商业化精液，目的是维持或增加受到威胁或面临严重灭绝风险的遗传群体的有效规模，或渗入具有动物技术意义的等位基因，使用进口或非进口材料，这些材料没有证明系谱鉴定或遗传价值量化的文件，经农业和畜牧业部分析后可获得授权。唯一款。必须提供研究机构进行的遗传或基因组研究，前提是它不会引起相关人员之间的利益冲突，并且必须证明遗传物质对国家畜群的重要性。第十一条 饲养者向精液采集和处理中心登记，采集精液供其主人畜群专用，不受本条例第二条第四项的要求限制。第十二条 2020年3月3日第13号规范性指示现予废止。第十三条 本条例自公布之日起生效。经农牧业部分析后方可授权。唯一款。必须提供研究机构进行的遗传或基因组研究，前提是它不会引起相关人员之间的利益冲突，并且必须证明遗传物质对国家畜群的重要性。第十一条 饲养者向精液采集和处理中心登记，采集精液供其主人畜群专用，不受本条例第二条第四项的要求限制。第十二条 2020年3月3日第13号规范性指示现予废止。第十三条 本条例自公布之日起生效。经农牧业部分析后方可授权。唯一款。必须提供研究机构进行的遗传或基因组研究，前提是它不会引起相关人员之间的利益冲突，并且必须证明遗传物质对国家畜群的重要性。第十一条 饲养者向精液采集和处理中心登记，采集精液供其主人畜群专用，不受本条例第二条第四项的要求限制。第十二条 2020年3月3日第13号规范性指示现予废止。第十三条 本条例自公布之日起生效。
CRISPR/Cas9 介导的猪受精卵基因组编辑前的透明带处理
Abkowitz, JL、Persik, MT、Shelton, GH、Ott, RL、Kiklevich, JV、Catlin, SN 和 Guttorp, P. (1995)。大型动物造血干细胞的行为。美国国家科学院院刊，92 (6)，2031–2035。https://doi.org/10.1073/pnas.92.6.2031 Brinkman, EK、Kousholt, AN、Harmsen, T.、Leemans, C.、Chen, T.、Jonkers, J. 和 Van Steensel, B. (2018)。模板引导的 CRISPR/Cas9 编辑的简易量化。核酸研究，46 (10)，e58。 https://doi.org/10.1093/nar/gky164 Le, QA, Hirata, M., Nguyen, NT, Takebayashi, K., Wittayarat, M., Sato, Y., Namula, Z., Nii, M., Tanihara, F., & Otoi, T. (2020)。使用不同浓度的 Cas9 蛋白和靶向肌肉生长抑制素 (MSTN) 基因的 gRNA 进行电穿孔处理对猪受精卵发育和基因编辑的影响。动物科学杂志，91 (1)，e13386。 https://doi.org/10.1111/asj.13386 Li, R.、Liu, Y.、Pedersen, HS、Kragh, PM 和 Callesen, H. (2013)。猪单性生殖胚胎去除透明带后的发育和质量。Theriogenology，80 (1)，58–64。https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2013.03.009 Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., & Gerdts, V. (2012)。猪：人类传染病的模型。微生物学趋势，20 (1)，50–57。Nishio, K., Tanihara, F., Nguyen, T.-V., Kunihara, T., Nii, M., Hirata, M., Takemoto, T., & Otoi, T. (2018)。电穿孔过程中电压强度对体外生产的猪胚胎发育和质量的影响。家畜繁殖，53 (2)，313–318。https://doi. org/10.1111/rda.13106 Peng, H., Wu, Y., & Zhang, Y. (2012)。通过电穿孔将 DNA 和吗啉代诺西酮有效递送到小鼠植入前胚胎中。PLoS One，7 (8)，e43748。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043748 Peura, TT, & Vajta, G. (2003)。绵羊和牛核移植中现有方法与新方法的比较。克隆干细胞，5 (4)，257–277。 https://doi.org/10.1089/153623003772032772 Qin, W., Dion, SL, Kutny, PM, Zhang, Y., Cheng, AW, Jillette, NL, Malhotra, A., Geurts, AM, Chen, Y.-G., & Wang, H. (2015). 通过合子电穿孔核酸酶在小鼠中实现高效的 CRISPR/Cas9 介导基因组编辑。遗传学，200 (2), 423–430。 https://doi.org/10.1534/ Genetics.115.176594 Remy, S., Chenouard, V., Tesson, L., Usal, C., Ménoret, S., Brusselle, L., Hes- lan, J.-M., Nguyen, TH, Bellien, J., Merot, J., De Cian, A., Giovannangeli, C., Concordet, J.-P., &Anegon, I. (2017). 通过使用电穿孔将 CRISPR/Cas9 蛋白和供体 DNA 递送到完整受精卵中来生成基因编辑大鼠。科学报告，7 (1)，16554。https://doi.org/10。 1038/s41598-017-16328-y Tanihara, F.、Hirata, M.、Nguyen, NT、Sawamoto, O.、Kikuchi, T.、Doi, M. 和 Otoi, T. (2020)。通过将 CRISPR/Cas9 系统电穿孔到体外受精的受精卵中有效生成 GGTA1 缺陷猪。BMC Biotechnology，20 (1)，40。https://doi.org/10.1186/s12896-020-00638-7