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利用 CRISPR/Cas9 对禾谷镰刀菌基因组进行意外大规模删除及其对生长和毒力的影响
摘要：禾谷镰刀菌是一种丝状真菌，是小麦和其他谷类作物赤霉病的病原体，在全球范围内造成了重大的经济损失。本研究旨在利用 CRISPR/Cas9 介导的基因缺失技术研究特定基因在禾谷镰刀菌毒力中的作用。使用 Illumina 测序来表征编辑引起的基因组变化。出乎意料的是，两个分离株中发生了 2 号染色体上 525,223 个碱基对的大规模缺失，包含超过 222 个基因。许多被删除的基因被预测与氧化还原酶活性、跨膜转运蛋白活性、水解酶活性等基本分子功能以及碳水化合物代谢和跨膜转运等生物过程有关。尽管遗传物质大量丢失，突变分离株在大多数条件下仍表现出正常的生长率和对小麦的毒性。然而，在高温和某些培养基中，生长率显著降低。此外，还进行了使用夹子浸种法、种子接种法和头点接种法的小麦接种试验。未观察到毒性的显著差异，这表明这些基因不参与感染或替代补偿途径，并允许真菌在基因组大量缺失的情况下保持致病性。
mRNA 疫苗可诱导针对铜绿假单胞菌 III 型分泌性毒力的保护性免疫
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2023 年 6 月 10 日发布。；https://doi.org/10.1101/2023.06.09.544431 doi：bioRxiv preprint
流行率，抗生素耐药性和毒力特征的单核细胞增生李斯特氏基因从牛奶中的牛奶中分离出来
研究了来自中国西南部云南省不同地区的牛奶中单核细胞增生李斯特菌的流行。使用脉冲 - 纤维凝胶电溶质（PFGE）及其毒力和抗生素耐药性潜在分析了全基因组测序（WGS）。从161个样品中的4个分离出总共8 L.单核细胞增生菌株，检测率为2.48％。所有菌株至少对一种抗生素具有抗性，大多数菌株（75％）均具有多抗生素抗性。将8个菌株聚集成3种脉冲型，每种脉冲型仅包含从相同地理区域分离的菌株。从每种脉冲型中选择了一个菌株的WG，发现总共从3种菌株中检测到了99个抗生素耐药基因和83个毒力基因，这表明从牛牛奶中分离出来的单核细胞增生李斯特菌具有强抗生素耐药性和毒力潜力。©2023 Elsevier Ltd.保留所有权利。
一种高效敲除肺炎克雷伯菌毒力质粒基因的方法
Chang 等，2012；Fazili 等，2016；Rossi 等，2018）。研究表明，赋予 hvKp 高毒力表型的最典型的毒力因子由位于毒力质粒上的基因编码，其中包括 iuc/iro（铁载体 aerobactin/salmochelin 的生物合成基因）、rmpA/rmpA2（增加荚膜产量的调节剂）和 peg-344（功能未知的代谢转运蛋白）（Russo and Marr，2019）。因此，大型毒力质粒上毒力基因的丢失将显著降低 hvKp 的毒力。尽管对hvKp毒力机制的研究已经取得了很大进展，但仍有许多问题尚未揭示：例如，毒力基因之间如何相互作用，它们如何调控hvKp的高毒力表型，以及毒力因子如何与宿主免疫系统相互作用。针对hvKp毒力质粒的有效基因编辑方法对于理解这些未知机制至关重要。目前，对hvKp毒力质粒进行基因敲除的报道很少，主要依赖于随机转座子插入和自杀质粒介导的同源重组（Cheng等，2010；
肺炎克雷伯菌中的 A-to-I RNA 编辑调节群体感应并影响细胞生长和毒力
在真核生物中，已报道并深入研究了数百万个从腺苷（A）到肌苷（I）的 RNA 编辑事件；然而，在原核生物中，许多特征和功能仍不清楚。通过结合 PacBio Sequel、Illumina 全基因组测序和两种具有不同毒力的肺炎克雷伯菌菌株的 RNA 测序数据，总共鉴定了 13 个 RNA 编辑事件。重点关注 badR 的 RNA 编辑事件，该事件在两种肺炎克雷伯菌菌株的编辑水平上有显著差异，预测为一个转录因子。在 DNA 上突变一个硬编码的 Cys 以模拟完全编辑 badR 的效果。转录组分析发现细胞群体感应（QS）途径是最显著的变化，表明 RNA 编辑对 badR 的动态调控与协调的集体行为有关。事实上，当细胞达到稳定期时，检测到自诱导物 2 活性和细胞生长的显著差异。此外，在 Galleria mellonella 感染模型中，突变菌株的毒力明显低于 WT 菌株。此外，badR 的 RNA 编辑调控在肺炎克雷伯菌菌株中高度保守。总体而言，这项工作为细菌的转录后调控提供了新的见解。
利用胞嘧啶碱基编辑进行 CRISPR-Cas 引导的福氏志贺氏菌染色体和毒力质粒诱变
摘要 志贺氏菌是一种革兰氏阴性细菌，可侵入人体肠道上皮。由此引起的感染志贺氏菌病是最致命的细菌性腹泻病。有关决定志贺氏菌病理生理的基因（包括染色体和毒力质粒）的大部分信息都是通过经典反向遗传学获得的。然而，流行的诱变技术的技术限制使得单次反应中只能产生少量突变体，从而阻碍了大规模的志贺氏菌靶向诱变和随后的表型评估。我们采用了一种 CRISPR-Cas 依赖性方法，其中切口酶 Cas9 和胞苷脱氨酶融合在单向导 RNA（sgRNA）的引导下引入靶向 C ！ T 转换，导致内部终止密码子和翻译过早终止。在使用 mCherry 荧光报告基因的原理验证实验中，我们能够在大肠杆菌和志贺氏菌中生成功能丧失突变体，效率高达 100%。使用改进的波动分析，我们确定在优化条件下，由 Cas9 脱氨酶融合引入的非靶向突变的频率与自发突变在同一范围内，这使我们的方法成为细菌诱变的安全选择。此外，我们对该方法进行了编程，以突变已充分表征的染色体和质粒携带的志贺氏菌基因，并发现突变体的表型与已报道的基因缺失突变体的表型相似，在表型水平上没有明显的极性效应。该方法可用于 96 孔板格式，以提高通量并在几天内生成一系列靶向功能丧失突变体。
耦合CRISPR/Cas9和Lambda Red重组工程系统对鸡沙门氏菌进行基因组编辑及ssaU敲除突变体对细菌毒力的影响
摘要：发展中国家的养禽业仍然面临着鸡伤寒的巨大威胁，这种疾病由鸡沙门氏菌引起，在经济较发达国家已得到较好的控制。除了大型毒力质粒 (85 kb) 表现出的毒力外，鸡沙门氏菌致病岛 2 还通过其 III 型分泌系统 (TTSS) 在介导疾病方面发挥关键作用。TTSS 分泌效应蛋白穿过含有沙门氏菌的液泡，并通过调节囊泡通道介导细菌的内化。在本研究中，使用 CRISPR/Cas9 和 lambda 重组系统通过同源定向修复，成功从本土分离的鸡沙门氏菌基因组中删除编码 III 型分泌系统的候选毒性 ssaU 基因 (~1 kb)。基于 CRISPR/Cas9 的家禽鸡沙门氏菌基因组编辑此前尚未见报道，这可能与其遗传工具效率低下有关。这是首次展示从该细菌基因组中完全进行基于 CRISPR/Cas9 的基因删除的研究。更重要的是，采用家禽实验模型评估了该突变菌株 (∆ ssaU_ S G18) 的毒力潜力，与野生型菌株相比，该突变菌株无法在实验攻毒的鸟类中产生任何死亡率。在我们的攻毒模型中，没有观察到对体重增加的影响，而细菌无法在肠道和肝脏中定植。突变菌株体内毒力的丧失使该系统具有出色的功能，可用于开发针对这种耐药性和致病性细菌的活疫苗。
特应性皮炎中金黄色葡萄球菌毒力因子的表达
特应性皮炎（AD）是一种皮肤炎症性疾病，其中机会性病原体金黄色葡萄球菌既普遍又丰富。S.金黄色葡萄球菌具有几种分泌的毒力因子，这些因子在感染模型中具有良好的功能，但尚不清楚这些细胞外微生物因子是否在AD的背景下是否相关。为了解决这个问题，我们设计了一种与文化无关的方法来检测和量化在皮肤部位表达的金黄色葡萄球菌毒力因子。我们利用rnase-h - 依赖性多重PCR进行了从胶带中提取的反转录的RNA的前透明化，这些RNA从具有不同严重程度的皮肤部位采样的患者的胶带条中提取，并评估了使用qPCR使用QPCR的S. aureus毒力因子的表达。我们观察到疾病严重程度增加的位点可行的金黄色葡萄球菌丰度增加，并且在AD皮肤部位表达了许多毒力因子。令人惊讶的是，与非静电对照相比，我们没有观察到病变部位的毒力因子的任何显着性。总体而言，我们利用了一个可靠的测定法直接检测和量化AD皮肤病变部位的可行金黄色葡萄球菌及其相关的毒力因子。该方法可以扩展以研究各种皮肤病学部位的皮肤微生物基因的表达。
评估炭疽疫苗对伊朗绵羊、山羊和豚鼠土壤中分离的高毒力炭疽杆菌菌株的攻击效果
糖皮质激素具有广泛的药理活性。一般而言，类固醇药物，例如地塞米松 (DEX)，会对不同器官的组织学产生严重的副作用。事实上，糖皮质激素被称为是能够治愈炎症并与免疫系统协同作用以治疗多种健康问题的强效药物。因此，本研究旨在调查 DEX 对肝脏和肾脏组织学变化以及血液生化参数的影响。总共将 13 只无特定病原体的雄性 Lepus cuniculus 兔子随机分成三组，年龄 8-10 月龄，平均体重为 1.12±0.13 公斤。第一组 (n=3) 未接受 DEX，仅接受生理盐水作为安慰剂（对照组）。第 II 组（n=5）动物接受 0.25 mg DEX/kg 体重/天，共治疗 56 天，第 III 组（n=5）动物接受 0.5 mg DEX/kg 体重/天，共治疗 56 天。从兔子耳缘静脉抽取血液。所有血液样本以 3000×g 离心 10 分钟，分离血清样本。测定血脂和微量元素（锌、铜、钙和铁）。通过观察组织的组织学变化对肝脏和肾脏组织进行显微镜分析。结果显示，身体和器官重量以及血清中微量元素的浓度显著（P ≤0.05）下降。另一方面，脂质谱显示胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白显著增加（P ≤0.05）。然而，与对照组相比，两个 DEX 治疗组的高密度脂蛋白均显著下降。组织学评估结果显示，治疗组的肾脏和肝脏组织出现一定程度的变性、坏死、细胞空泡和淋巴细胞浸润。关键词：地塞米松、必需矿物质、组织学、脂质谱