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重组嗜热菌 DNA 连接酶 (lig)，部分
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重组嗜热菌 DNA 连接酶 (lig)，部分
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嗜热菌 Cas9 的 HNH 核酸酶中静电接触的破坏会重新连接变构运动并增强高温 DNA 裂解
多结构域蛋白内的变构信号传导是空间上相距较远的功能位点之间通信的驱动因素。了解大型多结构域蛋白中变构耦合的机制是实现系统空间和时间控制的最有希望的途径。最近，CRISPR-Cas9 在分子生物学和医学领域的应用激增，这促使人们需要了解 Cas9 的原子级蛋白质动力学（这是其变构串扰的驱动力）如何影响其生物物理特性。在本研究中，我们使用核磁共振 (NMR) 和计算的协同方法来精确定位热稳定性 Geo Cas9 的 HNH 结构域中的变构热点。我们表明，K597 突变为丙氨酸会破坏盐桥网络，进而改变 Geo HNH 结构域的结构、变构运动的时间尺度和热稳定性。在广泛研究的中温 S. pyogenes Cas9 中，这种同源赖氨酸到丙氨酸的突变同样改变了 Sp HNH 域的动力学。我们之前已经证明，通过突变改变变构是 Sp Cas9 (e Sp Cas9) 特异性增强的来源。因此，这在 Geo Cas9 中可能也是如此。由 AIP Publishing 独家授权发布。https://doi.org/10.1063/5.0128815
超热活性 Cas9 编辑工具揭示了独特的亚砷酸甲基转移酶在嗜热菌 HB27 抗砷系统中的作用
摘要 从细菌到人类，许多生物体都存在砷解毒系统。在之前的研究中，我们在嗜热菌 Thermus thermophilus HB27 ( Tt SmtB ) 中发现了一个砷反应转录调节因子。在这里，我们更详细地描述了嗜热菌的砷抗性系统。我们采用基于 Tt SmtB 的下拉分析，对用砷酸盐和亚砷酸盐处理的培养物的蛋白质提取物进行研究，以获得 S -腺苷酸-L-蛋氨酸 (SAM) 依赖的亚砷酸盐甲基转移酶 ( Tt ArsM )。进行了体内和体外分析，以阐明砷抗性网络的这一新组成部分及其特殊的催化机制。在大肠杆菌中异源表达 TtarsM 可在中温温度下实现亚砷酸盐解毒。尽管 Tt ArsM 不含有典型的亚砷酸盐结合位点，但纯化的蛋白质确实会催化 SAM 依赖性的亚砷酸盐甲基化，形成单甲基亚砷酸盐 (MMA) 和二甲基亚砷酸盐 (DMA)。此外，体外分析证实了 Tt ArsM 和 Tt SmtB 之间的独特相互作用。接下来，开发了一种高效的基于 ThermoCas9 的基因组编辑工具，以删除嗜热菌基因组上的 Tt ArsM 编码基因，并确认其参与亚砷酸盐解毒系统。最后，用编码稳定化黄色荧光蛋白 (sYFP) 的基因取代嗜热菌 D TtarsM 基因组中的 TtarsX ef flux 泵基因，以创建灵敏的基于基因组的生物报告系统，用于检测砷离子。
改造海洋红嗜热菌中的类胡萝卜素生物合成途径以生产番茄红素
海洋红嗜热菌 (Rhodothermus marinus) 非常适合用于生物精炼，它是一种产生热稳定性酶的嗜氧嗜热菌，能够利用来自不同第二代和第三代生物质的多糖。这种细菌会产生有价值的化学物质，如类胡萝卜素。然而，天然的类胡萝卜素并不适用于工业生产，需要对海洋红嗜热菌进行基因改造才能生产出价值更高的类胡萝卜素。在这里，我们对类胡萝卜素生物合成基因簇进行了基因改造，产生了三种不同的突变体，最重要的是产生番茄红素的突变体 TK-3 (ΔtrpBΔpurAΔcruFcrtB::trpBcrtB T.thermophilus)。基因改造和随后对类胡萝卜素的结构分析有助于阐明海洋红嗜热菌中的类胡萝卜素生物合成途径。编码酶八氢番茄红素合酶 (CrtB) 和之前未鉴定的 10,20-水合酶 (CruF) 的核苷酸序列被发现融合在一起，并由 R. marinus 中的单个基因编码。仅删除基因的 cruF 部分不会产生活性 CrtB 酶。然而，通过删除整个基因并插入嗜热菌的 crtB 基因，获得了突变菌株，产生番茄红素作为唯一的类胡萝卜素。TK-3 产生的番茄红素定量为 0.49 g/kg CDW（细胞干重）。