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使用 CRISPR/Cas9 技术敲除莱茵衣藻中的 Cia5 基因并评估对照和突变分离株中的二氧化碳封存
摘要：CRISPR/Cas9 技术是基因组编辑和靶基因突变的常用方法之一，最近已用于操纵莱茵衣藻等微藻。此外，该技术还可以通过研究遗传途径来改良藻类菌株，在对抗温室气体（例如二氧化碳）产生方面发挥作用。在藻类中，有几种对 CO 2 作出反应的基因和控制每种基因表达的调节剂；Cia5 是最关键的转录调节剂之一。在本研究中，我们使用 CRISPR/Cas9 技术敲除 Cia5 基因，并分析了莱茵衣藻进行 CO 2 封存的能力。我们的结果表明，在 0.5% CO 2 浓度下，莱茵衣藻在对照和突变体物种中的表现（即对 CO 2 处理的响应）均优于其他浓度。然而，对照微藻种群和突变种群之间的差异在于 CO 2 去除效率。此外，我们的研究结果显示，对照型分离物在 CO 2 浓度为 0.04%、0.5% 和 1% 时去除效率分别为 27%、37% 和 21%。然而，对于相同浓度的突变种群，观察到的去除效率分别为 16%、23% 和 9%。
保守的钴胺素获取蛋白 1 对衣藻和褐指藻吸收维生素 B12 至关重要
* 通讯作者：as25@cam.ac.uk † 现地址：CRUK-AZ 功能基因组学中心，米尔纳治疗研究所，剑桥大学，Puddicombe Way，剑桥 CB2 0AW，英国。‡ 现地址：环境科学与技术研究所 (ICTA-UAB)，巴塞罗那自治大学 (UAB)，08193 Bellaterra (Cerdanyola del Vallès)，西班牙。§ 现地址：萨尔大学生物信息学中心和计算机科学系，萨尔布吕肯，德国。¶ 现地址：芝加哥大学生态与进化系，伊利诺伊州芝加哥 60637，美国。根据作者须知 (https://academic.oup.com/plphys/pages/General-Instructions) 中所述的政策，负责分发与本文所述研究结果相关的材料的作者是 Alison Smith (as25@cam.ac.uk)。
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TIM，一种利用 CRISPR/Cas9 在莱茵衣藻中进行的定向插入诱变方法
突变体的产生和随后的分析对于理解基因和蛋白质的功能至关重要。在这里，我们描述了 TIM，一种高效、经济、基于 CRISPR 的针对模型生物莱茵衣藻的靶向插入诱变方法。TIM 利用 Cas9 引导 RNA (gRNA) 核糖核蛋白 (RNP) 与外源双链（供体）DNA 一起递送到细胞中。供体 DNA 包含基因特异性同源臂和一个完整的抗生素抗性基因，该基因插入由 Cas9 产生的双链断裂处。在优化该方法的多个参数后，我们能够在两种不同的细胞壁菌株中为六种不同基因中的六种产生突变体，突变效率范围为 40% 到 95%。此外，这些高效率允许在单个实验中同时靶向两个不同的基因。 TIM 在许多参数方面都很灵活，可以使用电穿孔或玻璃珠法来传递 RNP 和供体 DNA。TIM 在 C . reinhardtii 中实现的突变率远高于之前报道的任何基于 CRISPR 的方法，并且有望对许多（如果不是全部）非必需核基因有效。
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