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World File Search System衣藻
莱茵衣藻 CLiP2 突变体集合通过高可信度破坏等位基因扩大基因组覆盖范围
作者：Alice Lunardon 1*、Weronika Patena 1*、Cole Pacini 1、Michelle Warren-Williams 1、Yuliya Zubak 1、Matthew Laudon 2、Carolyn Silflow 2、Paul Lefebvre 2、Martin Jonikas 1,3 1 普林斯顿大学，新泽西州，美国；2 明尼苏达大学，明尼苏达州，美国；3 霍华德休斯医学研究所 * 这些作者贡献相同。摘要。莱茵衣藻（以下简称衣藻）是研究光合作用、纤毛运动和其他细胞过程的有力模式生物 [1–4]。已映射的核随机插入突变体的 CLiP 文库 [5,6] 通过提供目标基因的突变体，加速了数百个实验室在这些领域的进展。然而，由于其对高置信度破坏等位基因的基因组覆盖率有限（46% 的核蛋白编码基因在外显子/内含子中具有 1+ 高置信度等位基因；12% 的基因在外显子/内含子中具有 3+ 等位基因），因此其价值受到限制。我们在此介绍 CLiP2（衣藻文库计划 2）文库，它大大扩展了可用的已映射高置信度插入突变体的数量。CLiP2 文库包含 71,700 个菌株，覆盖 79% 的核蛋白编码基因在外显子/内含子中具有 1+ 高置信度等位基因，以及 49% 的基因在外显子/内含子中具有 3+ 等位基因。社区可通过衣藻资源中心获取突变体。
微藻衣藻及其细菌联合体在解毒和生物生产中的应用
摘要：微藻具有广泛的代谢多样性、快速的生长速度和低成本的生产，使其成为各种生物技术应用的极具前景的资源，可满足工业、农业和医学领域的关键需求。微藻与细菌联合使用已被证明在生物技术的多个领域很有价值，包括处理各种类型的废水、生产生物肥料以及从其生物质中提取各种产品。微藻衣藻的单一培养多年来一直是一种重要的研究模型，并已广泛应用于光合作用、硫和磷代谢、氮代谢、呼吸和鞭毛合成等研究。最近的研究越来越多地认识到衣藻-细菌联合体作为各种应用的生物技术工具的潜力。使用衣藻及其细菌群落对废水进行解毒，为可持续减少污染物提供了巨大的潜力，同时促进了资源回收和微藻生物质的价值化。使用衣藻及其细菌群落作为生物肥料可以带来多种好处，例如增加作物产量、保护作物、保持土壤肥力和稳定性、有助于减缓二氧化碳排放以及有助于可持续农业实践。衣藻 - 细菌群落对高价值产品的生产起着重要作用，特别是在生物燃料的生产和氢气生产的增强方面。本综述旨在全面了解衣藻单一栽培及其细菌群落的潜力，以确定当前的应用并提出新的研发方向以最大限度地发挥其潜力。
保守的钴胺素获取蛋白 1 对衣藻和褐指藻吸收维生素 B12 至关重要
* 通讯作者：as25@cam.ac.uk † 现地址：CRUK-AZ 功能基因组学中心，米尔纳治疗研究所，剑桥大学，Puddicombe Way，剑桥 CB2 0AW，英国。‡ 现地址：环境科学与技术研究所 (ICTA-UAB)，巴塞罗那自治大学 (UAB)，08193 Bellaterra (Cerdanyola del Vallès)，西班牙。§ 现地址：萨尔大学生物信息学中心和计算机科学系，萨尔布吕肯，德国。¶ 现地址：芝加哥大学生态与进化系，伊利诺伊州芝加哥 60637，美国。根据作者须知 (https://academic.oup.com/plphys/pages/General-Instructions) 中所述的政策，负责分发与本文所述研究结果相关的材料的作者是 Alison Smith (as25@cam.ac.uk)。
莱茵衣藻生长状况和生物制品的趋势
选定论文后，在 Scopus 和 WoS 数据库上搜索，结果找到了 1969 年至 2022 年发表的 130 篇研究论文（图 1A）（表 S1）。所有分析的论文均以英语发表，因为英语是全世界科学交流的主要语言。23 出版物数量从 2013 年开始增加（5 篇论文），2021 年达到最高数量（18 篇论文）。多年来，以开放获取或每个订阅形式发表的论文数量保持不变。开放获取是一种增加期刊引用的工具，因为读者可以免费访问论文，研究人员和外部社区能够更轻松地获取最新的科学信息。24 另一方面，这种出版模式对某些作者来说可能具有挑战性，因为开放获取论文需要作者付费才能发表。
莱茵衣藻在 3D 水凝胶中的生长、分布和光合作用
工程生物材料 (ELM) 是一类新型功能材料，其特点是将生物成分在惰性聚合物基质内进行空间限制，以重现生物功能。了解基质内细胞群的生长和空间配置对于预测和改善其响应潜力和功能至关重要。本文研究了真核微藻莱茵衣藻 (C. reinhardtii) 在三维形状的水凝胶中的生长、空间分布和光合生产力，这些生长、空间分布和光合生产力取决于几何形状和尺寸。嵌入的莱茵衣藻细胞进行光合作用并形成受限的细胞簇，由于有利的气体交换和光照条件，当细胞簇靠近 ELM 外围时，它们生长得更快。利用位置特定的生长模式，这项研究成功设计和打印了具有更高 CO 2 捕获率的光合 ELM，具有高表面积体积比。这种控制细胞生长以提高 ELM 生产力的策略类似于多细胞植物叶片中已经建立的适应性。
莱茵衣藻乙酰辅酶A羧化酶（CrACCase）的计算机基因组编辑鉴定和功能蛋白变化
莱茵衣藻中的乙酰辅酶a羧化酶（CrACCase）是一种编码三酰甘油（TAG）和脂质（油体）合成的基因。CrACCase基因研究很少，尚未进行过计算机或体内遗传改造。在本研究中，我们为基因组编辑，特别是CrACCase提供了生物信息学精确信息。本研究旨在构建sgRNA并预测CrACCase假定突变蛋白的功能区域。根据分子鉴定结果，可以对最佳的CrACCase（GeneBank XM_001703135）进行计算机遗传改造。本研究中最佳的潜在 sgRNA 构建体为 GCGTCTGCTCAATCACACGGCGG、TTGAGGTCGGAACTCCAGCGG 和 AGGCAATACCCTCAATTGGGTGG，效率值分别为 79.27%、68.25% 和 65.17%。获得的最佳寡核苷酸 sgRNA 具有一个带有 NGG 的原间隔区相邻基序 (PAM) 位点，尤其是 CGG 和 TGG 的形式。工程化的 CrACCase 基因突变的位置位于莱茵衣藻基因组的 XM_001703135.1:1089 区域，尤其是在负链中。预测 CrACCase 蛋白具有 ACC 的羧基转移酶亚基、假定 PCC 的羧基转移酶亚基、酵母乙酰辅酶 A 羧化酶的人源化羧基转移酶结构域和乙酰辅酶 A 羧化酶的结构。 CrACCase 基因中的移码突变的变化影响了残基 D:C 92、95、111 和 114 处配体-蛋白结合位点功能区的结构变化，这些位点是锌离子结合位点。这种结构变化导致 CrACCase 蛋白的功能发生变化。这种生物信息学信息对于将来对 CrACCase 进行体内基因组编辑非常重要，这样就可以获得具有最高 TAG 产量或最高生物柴油（油体）产量的突变体。分子生物学家和生物技术专家可以将对莱茵衣藻中 CrACCase 基因的操纵应用于脂质百分比最高的其他微藻生物，以增加未来的生物能源产量。
分子进展使衣藻成为生物技术利用的宿主
由于近期取得的成就，莱茵衣藻正逐渐成为生物技术生产平台，我们将在本综述中简要总结这些成就。首先，由于近年来取得了一些令人印象深刻的改进，现在可以实现强大的核转基因表达。目前已有可实现高效、稳定核转基因表达的菌株，并且最近通过实现遗传杂交和识别其致病突变，使其更适合合理的生物技术方法。基于 Golden Gate 克隆的 MoClo 合成生物学策略是为衣藻开发的，它包括一个不断增长的工具包，其中包含 100 多个遗传部分，这些部分可以按照预定义的顺序进行稳健、快速的组装。这允许快速迭代转基因设计、构建、测试和学习。另一项重大进展来自各种改进转基因设计和表达的发现，例如系统地将内含子添加到密码子优化的编码序列中。最后，自 2016 年首次成功报道以来，CRISPR/Cas9 基因组编辑技术经历了多次改进，这为通过关闭竞争途径来优化生物合成途径提供了可能性。我们提供了一些例子，表明所有这些最新进展都牢固地确立了衣藻作为合成生物学底盘的地位，并允许将其代谢重新设计为新功能。
使用 CRISPR/Cas9 技术敲除莱茵衣藻中的 Cia5 基因并评估对照和突变分离株中的二氧化碳封存
摘要：CRISPR/Cas9 技术是基因组编辑和靶基因突变的常用方法之一，最近已用于操纵莱茵衣藻等微藻。此外，该技术还可以通过研究遗传途径来改良藻类菌株，在对抗温室气体（例如二氧化碳）产生方面发挥作用。在藻类中，有几种对 CO 2 作出反应的基因和控制每种基因表达的调节剂；Cia5 是最关键的转录调节剂之一。在本研究中，我们使用 CRISPR/Cas9 技术敲除 Cia5 基因，并分析了莱茵衣藻进行 CO 2 封存的能力。我们的结果表明，在 0.5% CO 2 浓度下，莱茵衣藻在对照和突变体物种中的表现（即对 CO 2 处理的响应）均优于其他浓度。然而，对照微藻种群和突变种群之间的差异在于 CO 2 去除效率。此外，我们的研究结果显示，对照型分离物在 CO 2 浓度为 0.04%、0.5% 和 1% 时去除效率分别为 27%、37% 和 21%。然而，对于相同浓度的突变种群，观察到的去除效率分别为 16%、23% 和 9%。
CRISPR-Cas 基因组编辑：衣藻基因操作的重大变革
摘要：微藻是地球上最丰富的光合单细胞真核生物之一，被认为是各种工业应用的替代可持续资源。衣藻是一种新兴的微藻模型，可通过多种生物技术工具进行操作，以生产高价值的生物产品，如生物燃料、生物活性肽、色素、保健食品和药物。具体而言，莱茵衣藻已成为不同基因编辑技术的研究对象，这些技术可用于调节微藻代谢物的产生。目前可用的主要核基因组编辑工具包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)，以及最近发现的成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)-CRISPR 相关蛋白 (Cas) 核酸酶系统。后者表现出了有趣的编辑能力，已成为基因组编辑的重要工具。在本综述中，我们重点介绍了有关 CRISPR-Cas 在莱茵衣藻基因工程中的方法和应用的现有文献，包括最近的转化方法、最常用的生物信息学工具、Cas 蛋白和 sgRNA 表达的最佳策略、CRISPR-Cas 介导的基因敲入/敲除策略，以及最后与 CRISPR 表达和修饰方法相关的文献。
TIM，一种利用 CRISPR/Cas9 在莱茵衣藻中进行的定向插入诱变方法
突变体的产生和随后的分析对于理解基因和蛋白质的功能至关重要。在这里，我们描述了 TIM，一种高效、经济、基于 CRISPR 的针对模型生物莱茵衣藻的靶向插入诱变方法。TIM 利用 Cas9 引导 RNA (gRNA) 核糖核蛋白 (RNP) 与外源双链（供体）DNA 一起递送到细胞中。供体 DNA 包含基因特异性同源臂和一个完整的抗生素抗性基因，该基因插入由 Cas9 产生的双链断裂处。在优化该方法的多个参数后，我们能够在两种不同的细胞壁菌株中为六种不同基因中的六种产生突变体，突变效率范围为 40% 到 95%。此外，这些高效率允许在单个实验中同时靶向两个不同的基因。 TIM 在许多参数方面都很灵活，可以使用电穿孔或玻璃珠法来传递 RNP 和供体 DNA。TIM 在 C . reinhardtii 中实现的突变率远高于之前报道的任何基于 CRISPR 的方法，并且有望对许多（如果不是全部）非必需核基因有效。