克氏

基于 CRISPR/Cas9 核糖开关的克氏锥虫基因表达下调方法

在最近引入 CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除、基因敲入、基因补充和内源基因标记之前，很少有基因工具可用于研究克氏锥虫。核糖开关是天然存在的自裂解 RNA（核酶），可被配体激活。我们实验室最近的研究结果证明了枯草芽孢杆菌中的 glmS 核酶可用于布氏锥虫的基因沉默，该核酶已被证明可控制响应外源葡萄糖胺的报告基因表达。在这项工作中，我们使用 CRISPR/Cas9 系统用活性（glmS）或非活性（M9）核酶对克氏锥虫糖蛋白 72（TcGP72）和液泡质子焦磷酸酶（TcVP1）进行内源性标记。通过 PCR 确认基因标记，并通过蛋白质印迹分析验证蛋白质下调。通过免疫荧光分析和体外生长定量进行进一步的表型表征。我们的结果表明，该方法成功地抑制了两种基因的表达，而无需培养基中的葡萄糖胺，这表明克氏锥虫在正常生长条件下产生足够水平的内源性葡萄糖胺 6-磷酸来刺激 glmS 核酶活性。该方法可用于敲除克氏锥虫中的必需基因并验证这种寄生虫中的潜在药物靶点。