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中尺度 DNA 特征影响 APOBEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性并塑造肿瘤突变景观
抗病毒 DNA 胞嘧啶脱氨酶 APOBEC3A 和 APOBEC3B 是癌症突变的主要来源，它们催化胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。APOBEC3A 优先靶向单链 DNA，对采用茎环二级结构的 DNA 区域具有明显的亲和力。然而，APOBEC3A 和 APOBEC3B 的详细底物偏好尚未完全确定，DNA 序列对 APO-BEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性的具体影响仍有待研究。在这里，我们发现 APOBEC3B 也选择性地靶向 DNA 茎环结构，它们与 APOBEC3A 脱氨的结构不同。我们开发了 Oligo-seq，这是一种基于体外测序的方法，用于识别促进 APOBEC3A 和 APOBEC3B 活性的特定序列环境。通过这种方法，我们证明了 APOBEC3A 和 APOBEC3B 脱氨酶活性受到目标胞嘧啶周围特定序列的强烈调控。此外，我们还确定了 APOBEC3B 和 APOBEC3A 的结构特征，这些特征决定了它们的底物偏好。重要的是，我们确定了肿瘤基因组内发夹形成序列中 APOBEC3B 诱导的突变与 APOBEC3A 突变的 DNA 茎环序列不同。总之，我们的研究提供了证据，表明 APOBEC3A 和 APOBEC3B 可以在癌症基因组中产生不同的突变景观，这是由它们独特的底物选择性驱动的。
多发性骨髓瘤：BET蛋白水解靶向嵌合分子与CDK9抑制剂联合治疗
细胞周期蛋白依赖性激酶 9 (CDK9) 与溴结构域和末端外结构域 (BET) 蛋白结合，通过磷酸化 RNAP II C 末端结构域的丝氨酸 2 来促进转录延长。我们在体外研究了选择性 CDK9 抑制剂 (AZD 4573 和 MC180295) 对人类多发性骨髓瘤细胞的治疗潜力。与对照细胞相比，多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中 CDK9 的短发夹 RNA 沉默降低了细胞活力，表明 MM 细胞对 CDK9 的依赖性。为了探索与 CDK9 抑制剂的协同作用，添加了蛋白水解靶向嵌合分子 (PROTAC) ARV 825。后一种药物导致 BET 蛋白泛素化，从而导致其快速高效降解。与单独使用任何一种药物相比，ARV 825 和 AZD 4573 联合治疗 MM 细胞可显著降低其 BRD 2、BRD 4、MYC 和磷酸化 RNA pol II 的蛋白质表达。联合治疗在体外和体内协同抑制多发性骨髓瘤细胞，且体重减轻不明显。与单独使用一种药物相比，该组合还导致低剂量的凋亡细胞显著增加。总之，我们的研究首次表明 BET PROTAC（ARV 825）和 AZD 4573（CDK9 抑制剂）的组合对 MM 细胞有效。
使用纳米孔直接 RNA 测序对基因治疗载体进行质量控制的优化方案
尽管最近在提高慢病毒基因疗法的疗效方面取得了进展，但相当一部分生产的载体含有不完整且可能无功能的 RNA 基因组。这可能会破坏慢病毒的基因传递，并增加制造成本，必须加以改进以促进慢病毒基因疗法的广泛临床实施。在这里，我们比较了三种长读测序技术检测载体设计问题的能力，并确定纳米孔直接 RNA 测序是最强大的。我们展示了这种方法如何识别和量化由隐蔽剪接和多聚腺苷酸化位点引起的不完整 RNA，包括广泛使用的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 (WPRE) 中的潜在隐蔽多聚腺苷酸化位点。使用慢病毒 RNA 的人工多聚腺苷酸化，我们还在分析的慢病毒载体中识别出多个发夹相关截断，这些截断占检测到的 RNA 片段的大部分。最后，我们表明这些见解可用于优化慢病毒载体设计。总之，纳米孔直接 RNA 测序是慢病毒载体质量控制和优化的有力工具，可能有助于改进慢病毒制造，从而开发更高质量的慢病毒基因疗法。
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通过裂域 CRISPR-Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，gRNA 开关可以设计为感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。
通过裂域 CRISPR–Cas12a gRNA 开关进行序列独立的 RNA 传感和 DNA 靶向
CRISPR 技术越来越需要对核酸酶活性进行时空和剂量控制。一种有前途的策略是将核酸酶活性与细胞的转录状态联系起来，通过设计引导 RNA (gRNA) 使其仅在与“触发”RNA 复合后发挥作用。然而，标准的 gRNA 开关设计不允许独立选择触发和引导序列，从而限制了 gRNA 开关的应用。在这里，我们展示了 Cas12a gRNA 开关的模块化设计，它可以将这些序列的选择分离。Cas12a gRNA 的 5' 端融合到两个不同且不重叠的结构域：一个与 gRNA 重复碱基配对，阻止 Cas12a 识别所需的发夹结构的形成；另一个与 RNA 触发物杂交，刺激 gRNA 重复的重新折叠和随后的 gRNA 依赖性的 Cas12a 活性。使用无细胞转录翻译系统和大肠杆菌，我们表明设计的 gRNA 开关可以响应不同的触发因素并靶向不同的 DNA 序列。调节传感域的长度和组成会改变 gRNA 开关的性能。最后，可以设计 gRNA 开关来感知仅在特定生长条件下表达的内源性 RNA，从而使 Cas12a 靶向活性依赖于细胞代谢和压力。因此，我们的设计框架进一步使 CRISPR 活性与细胞状态挂钩。
在DNA复制期间从模板切换中产生从头miRNA
即使对于具有极为约束的设计的microRNA（miRNA）基因，生成新基因和遗传信息的机制也是鲜为人知的。所有miRNA主要转录物都需要折叠成干循环结构，以产生与结合和拒绝其mRNA靶标结合和倒置的短基因产物（约22 nt）。虽然大量的miRNA基因是古老且高度保守的，但已证明编码完全新颖的miRNA基因的短次级结构以谱系特异性的方式出现。模板切换是一种与DNA复制相关的突变机制，可以在单个事件中引入复杂的变化并为整个发夹结构生成完美的基础配对。在这里我们表明，模板开关突变（TSM）参与了灵长类动物谱系中6,000多个合适的发夹结构的出现，以产生至少18个新的人类miRNA基因，即自从灵长类动物起源以来就已经出现的miRNA的26％。虽然该机制似乎是随机的，但TSM生成的miRNA富含内含子，可以用其宿主基因表达它们。TSM事件的高频提供了进化的原材料。比从从头创建基因创建的其他机制快的速度要快，TSM生成的miRNA可以使遗传信息的近乎静止状态和快速适应不断变化的环境。
工程科学博士
作者：约翰·W·班德勒教授 摘要 空间映射技术现已进入其开发和利用的第 20 个年头，它是一种充分利用工程师传统的“准全局”直觉的工程设计技术。通过适当的基于物理的替代方法，空间映射技术可以实现高保真或“精细模型”模拟精度但“粗糙模型”模拟速度的设计优化。它实现了从粗糙模型的简单映射中得到的替代方法的迭代增强，以实现相应精细模型的高精度替代方法。重要的是，空间映射技术为工程师对问题的神秘“感觉”提供了定量解释。由于其特征与当代理解的大脑执行某些任务的方式相似，我们断言空间映射技术模仿了“常识”。在这里，我们介绍了这一概念，回顾了重要的进展，将其与日常人类经验进行比较，指出了当前的技术水平，并提供了来自各种工程学科的说明，包括基于电磁学的微波设备建模和设计优化。积极空间映射是最广泛使用的技术，它有效地调用了传统优化的内循环——工作中的常识——通常在可接受的两到三次迭代中产生出色的结果。设计示例包括涉及 140 个优化变量的 10 通道输出多路复用器的优化、使用隐式空间映射的微波发夹滤波器的优化以及开环环形谐振器带通滤波器的调谐空间映射。
组蛋白去甲基化酶GASC1抑制剂靶向GASC1基因通过NOTCH-MAPK信号通路抑制食管癌恶性转化
摘要 .目的 .食管癌是我国常见的消化道肿瘤，发病率较高。组蛋白去甲基化酶4在染色体结构修饰和基因表达调控中起重要作用，成为肿瘤治疗的新靶点。GASC1是KDM4家族的重要成员，与肿瘤的恶性程度密切相关。方法 .构建KDM4C基因（又称GASC1）的短发夹状干扰RNA质粒和空白对照质粒，分别转染人食管鳞状细胞癌细胞株（KYSE-150和KYSE-30），根据细胞活力筛选最佳治疗浓度。细胞克隆实验分析各组细胞的增殖特性。细胞迁移和划痕愈合实验分析肿瘤的恶性转移和侵袭能力。免疫荧光分析检测蛋白GASC1的表达特性。采用Western blot方法分析各组细胞株中蛋白Notch1、HIF1A、Flt-1、c-myc、c-fos的表达情况。结果.本实验通过加入咖啡酸及干扰RNA质粒调控各组GASC1蛋白的表达水平，之后通过一系列表征方法确定食管癌细胞的转移和增殖能力与GASC1蛋白表达水平呈正相关。通过测定各癌相关蛋白的表达情况，进一步证明GASC1蛋白的调控作用。结论.GASC1基因在食管癌的进展中起着至关重要的作用，通过抑制GASC1基因的表达，与癌症发展密切相关的NOTCH、MAPK等通路也会受到抑制，最终可能控制恶性发展。
DNA测序
1。底漆设计和反应设置我应该如何设计序列底漆？引物应至少长18个碱基，以确保良好的杂交尝试达到约55-60°C的T mGC含量应约为50-55％。较高的GC内容可能会导致变性不完整避免二级结构（作为发夹），尤其是在3'末端避免使用四个或更多一个基础的串链•可以避免可以混合形成二聚体的底漆不应避免使用替代性混合杂交站点。是的，重要的是考虑退火温度与底漆匹配。一般规则是，循环方案中的退火温度低于底漆的熔化温度（T m）。t m（大约）=（no a/t x 2） +（g/c x 4的否）通常，将退火温度为50-55°C，从标准引物中给出良好的序列。是否有可能减少测序预混合的量？是的，预用含有剩余的试剂。首先做出第四季度大小的反应。如果序列结果良好并且信号峰很强，则可以进一步稀释该试剂盒。始终使用套件中包含的稀释缓冲液，并将最终体积保持在20µL。保持DNA和底漆不变。请注意，仅当您使用相同类型的模板和底漆进行序列时，建议这样做。如果您使用新底漆或在DNA模板准备中进行更改，请返回到套件的第四季度稀释度并检查序列的结果。