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新颖的目标，它们的设计，交付和临床潜力
包括核苷酸实体的疗法是非常广泛的类别，涵盖了核苷酸类似物，寡核苷酸和基于核酸的疗法。核苷酸/基于核苷的药物已经进行了很好的探索，临床批准的候选者是抗病毒，抗癌，抗细菌和抗毛状细胞类似（Garner，2021）。寡核苷酸疗法是相对近期且有前途的，包括反义寡核苷酸（ASOS），小型干扰RNA（siRNA），短发夹RNA（SHRNAS），抗菌毛（抗微生物）（抗MIRS）。寡核苷酸选择性地结合RNA或蛋白质，阻断其功能或促进降解。寡核苷酸疗法显示出在治疗遗传疾病，癌症，病毒感染和神经退行性疾病方面的潜力（Roberts，2020年）。目前，批准了15种寡核苷酸疗法治疗美国各种罕见疾病，其中四种批准针对Duchenne肌肉营养不良。尤其是在2020年3月，Viltolarsen的批准引起了全世界研究人员对寡核苷酸疗法的关注（Igarashi，2022年）。基于核酸的疗法包括长多核苷酸的靶向疾病，旨在调节基因表达，正确的遗传突变或干扰引起疾病的过程（Sridharan，2016）。发现CRISPR-CAS9基因编辑技术已彻底改变了基于核酸的治疗剂，但仍在研究持久的研究，以改善其递送方法，增强靶向特异性，并确保此类治疗剂的安全和效果（Udddin，2020）。发现CRISPR-CAS9基因编辑技术已彻底改变了基于核酸的治疗剂，但仍在研究持久的研究，以改善其递送方法，增强靶向特异性，并确保此类治疗剂的安全和效果（Udddin，2020）。研究人员正在努力继续探索寡核苷酸的转化潜力，同时解决了各种相关的挑战，例如特殊的挑战，交付，
PD-1下调通过保留细胞记忆表型并减少疲惫来提高CAR-T细胞抗肿瘤效率
抽象的背景尽管在管理复发或难治性多发性骨髓瘤（RRMM）患者方面靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的结果令人鼓舞，但Cart-T细胞的治疗副作用和功能障碍限制了这种有望的方法的效率和临床应用。在这项研究中，我们将靶向PD-1的短发夹RNA盒纳入了具有OX-40共刺激结构域的BCMA车。在暴露于单个或重复的抗原刺激下，评估了转导的PD-1 KD CAR-T细胞的表面CAR表达，T细胞增殖，细胞毒性，细胞因子产生和亚群。在RRMM患者的I期临床试验中最初观察到安全性和功效。与亲本BCMA CAR-T细胞相比，PD-1 KD BCMA CAR-T细胞疗法显示，T细胞疲劳减少，体外记忆T细胞的百分比增加。在PD-1 KD BCMA CAR-T组中，还观察到体内更好的抗肿瘤活性。在七名RRMM患者的CAR-T细胞疗法的I期临床试验中，最初在所有七名患者中观察到安全性和功效，其中包括至少1名患者（4/7，57.1％），其中1例至少有1名患者和四名患者（4/7，57.1％），具有高风险的细胞遗传学。总回应率为85.7％（6/7）。四名患者有严格的完全反应（SCR），一名患者患有CR，一名患者有部分反应，一名患者患有稳定的疾病。的安全性，其发生率是轻度至中度细胞因子释放综合征，并且没有神经毒性的发生。结论我们的研究表明了独立于抗原特异性的CAR-T细胞的设计概念，并提供了提高CAR-T细胞疗法功效的替代方法。
果蝇中的单个转录本的组合遗传扰动的多顺基因转基因设计
捕获人类疾病遗传复杂性并允许对基础细胞，组织和器官相互作用进行机械探索的实验模型对于使我们对疾病生物学的理解至关重要。这样的模型需要对多个基因的组合操作，通常是一次以上的组织。在体内进行复杂的遗传操作的能力是果蝇的关键优势，其中许多用于复杂和正交遗传扰动的工具。然而，在这些已经复杂的遗传背景中建立更多代表性疾病模型和进行机械研究所需的大量转基因是具有挑战性的。在这里，我们提出了一种设计，该设计通过允许靶向组合异位表达和来自单个诱导型转基因的多个基因敲低的靶向组合异位表达来推动果蝇遗传学的极限。由该转基因编码的多余体转录本包括一个合成的短发夹簇，它克隆在转录本的5'末端的内含子中，然后是两个蛋白质编码序列，该蛋白质编码序列由介导核糖体跳过的T2A序列分开。这项技术对于建模癌症等遗传复杂疾病特别有用，癌症通常涉及多发性肿瘤基因的同时激活和多PLE肿瘤抑制剂的丧失。此外，将多种遗传扰动巩固到single转基因中，进一步简化了执行组合遗传操作的能力，并使其很容易适应广泛的转基因系统。这种用于组合遗传扰动的灵活设计也将是一种有价值的工具，用于探索从人类疾病的OMICS研究中鉴定出的多基因基因特征并创建人源化的果蝇模型，以表征人类基因中与疾病相关的变体。它也可以适用于研究正常组织稳态和发展需要同时操纵许多基因的生物学过程。
DROSHA，但不是人类造血干细胞功能
目标。DROSHA和DICER在microRNA（miRNA）的生物发生中具有中心作用。然而，我们先前表明，在鼠系统中，Drosha具有替代功能，可以直接识别和切割蛋白质编码的信使（M）RNA，这对于维护造血干细胞（HSC）的多能力至关重要。维持鼠HSC功能取决于Drosha介导的两个mRNA，myl9和todR1的裂解。这项研究的目的是确定该途径是否在人类HSC中保存。方法。DROSHA和DICER用短发夹RNA击倒了人绳CD34 + HSC。在体外和人类小鼠中分析了HSC的功能。通过捕获5 0磷酸化的RNA进行mRNA裂解的分析。结果。与鼠类HSC一致，Drosha敲低损害了人类HSC在体外的分化，并植入了人类小鼠，而迪切尔的敲低却没有影响。drosha在人类HSC和Drosha缺乏效率中切割MYL9 mRNA导致mRNA的积累。但是，Myl9的异位表达并不损害人类HSC的功能。 我们无法识别人类对TODR1的同源物。 结论。 DROSHA的miRNA无关函数对于人类HSC的功能至关重要。 Drosha直接识别并降低了人类HSC中的mRNA。 然而，与鼠HSC不同，仅MYL9 mRNA的降解对于人HSC功能并不是至关重要的。但是，Myl9的异位表达并不损害人类HSC的功能。我们无法识别人类对TODR1的同源物。结论。DROSHA的miRNA无关函数对于人类HSC的功能至关重要。Drosha直接识别并降低了人类HSC中的mRNA。然而，与鼠HSC不同，仅MYL9 mRNA的降解对于人HSC功能并不是至关重要的。因此，Drosha必须抑制其他靶标和/或具有另一种与miRNA无关的功能，这对于保护人类HSC的多能性至关重要。
胰腺癌中的circrnas
摘要。我们已经回顾了圆环RNA（CIRCRNA）的文献，在临床前胰腺癌中具有功效相关的体内模型。鉴定出的CIRCRNA靶化学抗性机制（n = 5），分泌的蛋白质和跨膜受体（n = 15），转录因子（n = 9），信号传导的成分 - （n = 11），泛素化 - （n = 2） - （n = 2），自噬系统（自动噬菌体）（n = 2）和其他（n = 9）。除了确定治疗性干预靶标外，CIRCRNA是治疗胰腺癌的潜在新实体。可以通过反义寡核苷酸（ASO），小型干扰RNA（siRNA），短发夹RNA（SHRNA）或定期散布的短上粒子短上粒细胞激素重复蛋白相关蛋白（CRISPR-CAS）基于基于的 - 基于基于短上的蛋白质（CRISPR-CAS） - 基于基于限制的可以抑制。 使用质粒或基于病毒的载体系统替换疗法可以重新构成下调的CIRCRNA的功能。 检查了目标验证实验和改进的相应剂输送系统的开发。 胰腺癌是癌症死亡的第三个总体原因，2022年全球每年60 000次发病率（1）。 手术后的五年生存中位数约为20％，只有15-20％的患者有资格进行诊断（2）。 目前，Abraxane，Paclitaxel-可以抑制。 使用质粒或基于病毒的载体系统替换疗法可以重新构成下调的CIRCRNA的功能。 检查了目标验证实验和改进的相应剂输送系统的开发。 胰腺癌是癌症死亡的第三个总体原因，2022年全球每年60 000次发病率（1）。 手术后的五年生存中位数约为20％，只有15-20％的患者有资格进行诊断（2）。 目前，Abraxane，Paclitaxel-。使用质粒或基于病毒的载体系统替换疗法可以重新构成下调的CIRCRNA的功能。检查了目标验证实验和改进的相应剂输送系统的开发。胰腺癌是癌症死亡的第三个总体原因，2022年全球每年60 000次发病率（1）。手术后的五年生存中位数约为20％，只有15-20％的患者有资格进行诊断（2）。目前，Abraxane，Paclitaxel-
toehold介导的链位移的单分子力光谱
toehold介导的链位移的单分子力光谱Andreas Walbrun 1，*，Tianhe Wang 2，*，Michael Matthies 2，Petršulc2,3，Friedrich C. Simmel 2，+ Matthias Rief，Matthias Rief 1慕尼黑技术大学生物科学系综合蛋白质科学中心（CPA），Ernst-Otto-Fischer-STR。8，85748德国Garching。 电子邮件：matthias.rief@mytum.de 2。 慕尼黑技术大学，TUM自然科学学院，生物科学系，AM COULOMBWALL 4A，85748 GARCHING，德国。 电子邮件：simmel@tum.de 3。 亚利桑那州立大学生物设计学院的分子科学和分子设计与生物仪中心，美国亚利桑那州南卡利斯特大街1001号，美国亚利桑那州坦佩市85281，美国 *这些作者同样贡献：安德烈亚斯·沃尔布伦（Andreas Walbrun） （TMSD）在动态DNA纳米技术中广泛使用，并且是多种基于DNA或RNA的反应电路的基础。 以前的研究通常依赖于散装荧光测量值来研究TMSD的动力学，该动力学仅提供有效的，散装平均的反应速率，并且无法在单个分子甚至碱基对的水平上解决该过程。 在这项工作中，我们使用单分子力光谱（SMF）探索单分子水平的链位移过程的动力学，并具有由最先进的粗粒元模拟支持的光学陷阱。 此外，我们使用力研究了DNA入侵RNA的动力学，这一过程很少发生力。8，85748德国Garching。电子邮件：matthias.rief@mytum.de 2。慕尼黑技术大学，TUM自然科学学院，生物科学系，AM COULOMBWALL 4A，85748 GARCHING，德国。电子邮件：simmel@tum.de 3。亚利桑那州立大学生物设计学院的分子科学和分子设计与生物仪中心，美国亚利桑那州南卡利斯特大街1001号，美国亚利桑那州坦佩市85281，美国 *这些作者同样贡献：安德烈亚斯·沃尔布伦（Andreas Walbrun） （TMSD）在动态DNA纳米技术中广泛使用，并且是多种基于DNA或RNA的反应电路的基础。 以前的研究通常依赖于散装荧光测量值来研究TMSD的动力学，该动力学仅提供有效的，散装平均的反应速率，并且无法在单个分子甚至碱基对的水平上解决该过程。 在这项工作中，我们使用单分子力光谱（SMF）探索单分子水平的链位移过程的动力学，并具有由最先进的粗粒元模拟支持的光学陷阱。 此外，我们使用力研究了DNA入侵RNA的动力学，这一过程很少发生力。亚利桑那州立大学生物设计学院的分子科学和分子设计与生物仪中心，美国亚利桑那州南卡利斯特大街1001号，美国亚利桑那州坦佩市85281，美国 *这些作者同样贡献：安德烈亚斯·沃尔布伦（Andreas Walbrun） （TMSD）在动态DNA纳米技术中广泛使用，并且是多种基于DNA或RNA的反应电路的基础。以前的研究通常依赖于散装荧光测量值来研究TMSD的动力学，该动力学仅提供有效的，散装平均的反应速率，并且无法在单个分子甚至碱基对的水平上解决该过程。在这项工作中，我们使用单分子力光谱（SMF）探索单分子水平的链位移过程的动力学，并具有由最先进的粗粒元模拟支持的光学陷阱。此外，我们使用力研究了DNA入侵RNA的动力学，这一过程很少发生力。通过探测toehold结构的发夹的末端，我们可以通过微秒和纳米分辨率实时触发和观察TMSD。使用微流体测定法，我们将发夹暴露于触发链的溶液中，我们发现在负载下，TMSD的进行非常迅速，单步时间为1 µs。将不匹配引入入侵者序列使我们能够调节稳定性，以使入侵和重新染色在均衡中也发生，即使在负载下也是如此。这使我们能够在单个分子上研究数千个入侵/入侵事件，并分析入侵过程的动力学。将我们的发现推送到零载荷，我们发现DNA入侵DNA的单步速度比入侵RNA快的速度快四倍。我们的结果揭示了序列效应对TMSD过程的重要性，并且对于核酸纳米技术和合成生物学的广泛应用至关重要。关键字：肋骨调节器，脚趾介导的链位移，分支迁移，单分子力光谱
在癌变中，RNA编辑在癌组织中的影响
抽象的RNA编辑是在正常生理过程中观察到的最普遍，最丰富的转录后RNA修饰形式之一，在包括癌症在内的疾病中通常异常。RNA编辑会改变mRNA的序列，使其与源DNA序列不同。编辑的mRNA可以产生与相应基因组编码的蛋白质同工型功能不同的编辑蛋白质同工型。哺乳动物中的主要类型RNA编辑是通过在双链RNA（DSRNA）中或前mRNA转录本中的双链RNA（DSRNA）或发夹中酶脱氨酸对腺苷（A-to-I）的酶促脱氨酸的。催化这些过程的酶属于作用于RNA（ADAR）家族的腺苷脱氨酶。 使用体外癌细胞培养模型获得了与人类疾病相关的RNA编辑景观的绝大多数知识。 但是，这种体外模型的局限性是，获得的结果的生理或疾病相关性不一定是显而易见的。 在这篇综述中，我们专注于讨论在人类癌组织中使用手术切除或从患者临床检索的样品中发现的RNA编辑事件。 我们讨论体内肿瘤中发生的RNA编辑事件如何识别与人类癌症生理学相关的病理信号传导机制，这与癌症进展的不同阶段有关，包括起始，促进，生存，生存，增殖，免疫逃生和转移。催化这些过程的酶属于作用于RNA（ADAR）家族的腺苷脱氨酶。使用体外癌细胞培养模型获得了与人类疾病相关的RNA编辑景观的绝大多数知识。但是，这种体外模型的局限性是，获得的结果的生理或疾病相关性不一定是显而易见的。在这篇综述中，我们专注于讨论在人类癌组织中使用手术切除或从患者临床检索的样品中发现的RNA编辑事件。我们讨论体内肿瘤中发生的RNA编辑事件如何识别与人类癌症生理学相关的病理信号传导机制，这与癌症进展的不同阶段有关，包括起始，促进，生存，生存，增殖，免疫逃生和转移。
探索病毒式伪notted RNA结构的从头算预测方法的准确性：回顾性队列研究
背景：第三级RNA结构的预测对医学领域（例如Messenger RNA [mRNA]疫苗，基因组编辑）和病毒转录物的探索很重要。尽管存在许多RNA折叠软件程序，但很少有研究仅将其关注的源头简化为病毒式Pseudoknotted RNA。这些调控假诺在基因组复制，基因表达和蛋白质合成中起作用。目的：本研究的目的是探索5个RNA折叠引擎，该发动机用于计算最低自由能（MFE）或最大期望准确性（MEA），当应用于先前使用诱变，序列比较，结构探测，结构探测，或核磁共振（NMR）的特定病毒式Pseudoknotted RNA。方法：对本研究中使用的折叠发动机进行了26次实验得出的短伪序列（20-150 nt），使用在测试软件预测准确性时很常见的指标：百分比误差，平均平方误差（MSE），敏感性，敏感性，敏感性，积极的预测值（PPV），Youden的INDEX（Youden's Intex（j）和f 1-score。本研究中使用的数据集来自包含398个RNA的pseudobase ++数据库，该数据库使用PRISMA（系统审查和荟萃分析的首选报告项目）的一组包含和排除标准进行了评估。在Mathews的参数之后，给定RNA序列内的基本配对被认为是正确或不正确的。结果：本文与以前的软件的迭代相比，与较旧的折叠引擎相比，RNA预测引擎具有更高的精度，例如PKISS。本文还报道说，当使用诸如F 1 -SCORE和PPV等指标评估时，MEA折叠软件并不总是以预测准确性的MFE折叠软件，而当应用于病毒式PseudokNotted RNA时。此外，结果表明，如果不应用辅助参数，例如Mg 2+结合，悬挂式最终选项和发夹型惩罚，则热力学模型参数将无法确保准确性。结论：这是将一套RNA折叠发动机套件应用于仅包含病毒式伪KNOTED RNA的数据集的首次尝试。本文报道的观察结果突出了不同的从头算预测方法之间的质量，同时实施了这样一种想法，即对更有效的RNA筛选更有效地了解细胞内热力学是必要的。
体外 CRISPR/CasRx 介导的 RNA 编辑方法
与使用 CRISPR/Cas 系统进行 DNA 操作不同，关于基于 CRISPR/Cas 的 RNA 修饰的文献严重缺乏。最近，科学家对 Cas13 酶进行了表征，并证明可编程 RNA 编辑在效率和特异性方面优于现有的 RNA 靶向方法（Abudayyeh 等人，2017 年；Cox 等人，2017 年；Liu 等人，2017 年；Konermann 等人，2018 年）。据报道，由于缺乏基因组改变，CRISPR/Cas13 也比现有的 CRISPR/Cas 系统更安全。2018 年，最小的 RNA 靶向 Cas 核酸酶 Cas13d 被描述。在 Cas13d 家族中，来自 Ruminococcus flavifaciens 的 CasRx（也称为 RfxCas13d）具有最高的 RNA 裂解活性和在人类细胞中的特异性。CasRx 的 RNA 靶向也比短发夹 RNA (shRNA) 干扰效果更好。重要的是，Cas13d 核酸酶可以处理 CRISPR 阵列，从而实现多重靶向（Konermann 等人，2018 年）。随后对 CasRx 的研究表明，在各种动物模型中可以有效地敲低信使 RNA (mRNA)，并在植物中实现转基因表达（Mahas 等人，2019 年；Kushawah 等人，2020 年）。值得注意的是，使用 AAV 载体在新生血管性年龄相关性黄斑变性 (nAMD) 小鼠模型中证明了 CRISPR/CasRx 的治疗潜力。 CRISPR/CasRx 系统的递送成功抑制了血管内皮生长因子 (VEGF) 的 mRNA，这是致病性眼部血管生成的关键因素，并且随后显示出脉络膜新生血管 (CNV) 面积的减少，这是 nAMD 的标志 ( Zhou et al., 2020 )。这些研究表明 CRISPR/CasRx 系统的治疗潜力。在这里，我们描述了三种不同的方法来有效地进行 CRISPR/CasRx 介导的血管内皮生长因子 A (VEGFA) 的 RNA 敲低。我们通过靶向 VEGFA mRNA，使用不同形式的单向导 RNA (sgRNA) 检查了 CRISPR/CasRx 系统的 RNA 敲低效率。为了应用于治疗学开发，我们生成了由 CasRx 和单个前 sgRNA 或多个前 sgRNA（阵列）组成的一体化 AAV 构建体，以检查系统的 RNA 敲除效率。本文介绍了使用 CasRx 和向导 RNA 变体进行体外 RNA 编辑的指导手册。
一天内构建多重阵列以利用天然 CRISPR 系统
摘要 CRISPR-Cas 系统是一种原核免疫系统，不仅在细菌和古细菌中广泛增殖，而且最近在人类生物学研究和应用中也广泛存在。迄今为止，许多工作都利用了合成的 sgRNA 和 CRISPR 核酸酶 Cas9，但阵列处理核酸酶的发现现在允许在异源宿主以及具有内源系统的生物体中使用更紧凑、天然的 CRISPR 阵列。不幸的是，多重天然 CRISPR 阵列的构建在技术上仍然具有挑战性、成本高昂和/或耗时。这种限制阻碍了在天然和异源宿主中涉及天然 CRISPR 阵列的研究。为了解决这个问题，我们提出了一种组装 CRISPR 阵列的方法，这种方法简单、快速、经济实惠且高度可扩展——我们用一天的工作组装了 9 间隔阵列。我们利用这种方法来利用高能力细菌 Acinetobacter baylyi 的内源性 CRISPR 系统，结果表明虽然单个间隔区并不总是能够完全有效地阻止通过天然能力获取 DNA，但多重天然 CRISPR 阵列可以实现几乎完全的 DNA 排除和基因组编辑，包括两者的多个靶标。除了展示一种将使各种应用受益的 CRISPR 阵列组装方法之外，我们还发现了一种潜在的对冲策略，用于平衡 CRISPR 防御与天然能力的 A. baylyi 中的 DNA 获取。CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）-Cas 系统是一种适应性免疫机制，通常通过检测和切割确定的靶序列 1 来保护细菌和古菌免受核酸入侵。CRISPR 系统包括 Cas（CRISPR 相关）蛋白，以及与同样短的 DNA 间隔区交替的同名短直接重复序列阵列。间隔序列被转录成较长的前体crRNA，然后前体crRNA被加工成单个crRNA（CRISPR RNA），每个crRNA由与特定核酸靶标互补的单个间隔序列以及通常源自重复序列的发夹柄组成。这些crRNA与Cas效应蛋白（如Cas9）或蛋白质复合物（如CASCADE）结合。一旦结合，它们就会根据系统引导效应子到互补的DNA或RNA上，效应子通常会切割这些DNA或RNA。很快，许多实验室就将CRISPR介导的DNA切割应用于从精确的基因组工程到基因回路2到靶向的细菌菌株去除3-6等各种应用。自扩散的CRISPR构建体也被用于快速产生纯合二倍体敲除（诱变链式反应）7，初步研究表明