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提高四级护理转诊中心外显子组测序的有效性：罕见神经遗传疾病中的新突变、临床表现和诊断挑战
摘要 背景 我们采用多模式方法，包括详细表型分析、全外显子组测序 (WES) 和候选基因过滤器，对三级神经病学中心转诊的个体进行罕见神经系统疾病诊断。方法 使用候选基因过滤器和严格的算法对 66 名患有神经遗传疾病的个体进行 WES，以评估序列变异。使用计算机预测工具、家族分离分析、先前的疾病关联出版物和相关生物学检测来解释致病或可能致病的错义变异。结果 39% (n=26) 的病例实现了分子诊断，其中包括 59% 的儿童期发病病例和 27% 的晚发型病例。总体而言，37% (10/27) 的肌病、41% (9/22) 的神经病变、22% (2/9) 的 MND 和 63% (5/8) 的复杂表型得到了基因诊断。已鉴定出 27 种与疾病相关的变异，包括 FBXO38、LAMA2、MFN2、MYH7、PNPLA6、SH3TC2 和 SPTLC1 中的 10 种新变异。单核苷酸变异 (n=10) 影响功能域内的保守残基和先前鉴定的突变热点。已确定的致病变异 (n=16) 表现出非典型特征，例如成人多聚葡聚糖体病的视神经病变、脑腱黄瘤病的面部畸形和骨骼异常、先天性肌无力综合征 10 的类固醇反应性虚弱。诊断出可能可治疗的罕见疾病，改善了部分患者的生活质量。结论 整合深度表型分析、基因过滤算法和生物检测提高了外显子组测序的诊断产量，发现了新的致病变异，并扩展了门诊环境中难以诊断的罕见神经遗传疾病的表型。
一个新颖的外显子14跳突变对肺腺癌中克里唑替尼的反应
为了探测靶向治疗的肿瘤的基因组谱，对组织标本和相关的血液样本进行了NGS分析，并确定了Met Exon 14跳过突变（C.3026_3028+11DEL）（图1B和1C）。未发现其他驱动基因变体。突变等位基因频率为33.87％。同样，组织样品的放大片段小于18S rRNA，与Met Exon 14跳过H569细胞系相似，进一步证实了Met Exon 14跳过的出现（图1D）。根据这些发现，患者每天两次开始用250毫克Crizotinib治疗。最值得注意的是，经过一个月的治疗后成像显示肿瘤显着减少。他的肺肿瘤的大小为1.0 cm×0.8 ccm×0.4 cm，符合recist的部分反应标准（-98％，图1E）。这持续了4个月，直到他经历了与疾病无关的死亡。
使用CRISPR/CAS9系统在DMD基因中淘汰外显子48
抽象背景：DMD基因中的框架突变导致Duchenne肌肉营养不良（DMD），这是一种神经肌肉进行性遗传疾病。在DMD患者中，缺乏肌营养不良蛋白会导致进行性肌肉变性，从而导致心脏和呼吸道衰竭导致过早死亡。目前，尚无对DMD的某些治疗方法。dmd基因是2.2巨型碱基对的人类基因组中最大的基因，并包含79个外显子。在过去的几年中，基因疗法被认为是一种有希望的DMD治疗，在各种基因编辑技术中，CRISPR/CAS9系统被证明更加精确和可靠。这项研究的目的是评估使用一对SGRNA敲除外显子48的可能性。方法：一对指导RNA（GRNA）设计用于切割DMD基因，并诱导外显子48的缺失。将GRNA转接为HEK-293细胞系，然后通过PCR分析基因组DNA中的DELENEC，然后通过PCR和随后的Sanger测序分析。结果：外显子48被成功删除，因此外显子47连接到外显子49。结论：此结果表明CRISPR/CAS9系统可用于精确编辑DMD基因。关键字：CRISPR/CAS9，肌营养不良，基因编辑，肌肉营养不良简介
非小细胞肺癌 MET 外显子 14 跳跃变异的当前和未来治疗选择
近膜 (JX) 结构域，其中包含 PKC 磷酸化位点 (S985)、胱天蛋白酶切割位点 (D1002) 和 E3 泛素连接酶 CBL (Casitas-B 系淋巴瘤) 对接位点 (Y1003)，均控制 RTK 活性的下调 (图 1a)。3–7 这种改变破坏了外显子 14 两侧的内含子剪接位点，包括内含子 13 的剪接受体位点和内含子 14 的剪接供体位点，或外显子 14 编码序列本身内的突变，都会导致外显子 14 在转录本中跳跃。这些突变中最常见的是碱基替换，其次是插入/缺失。因此，导致MET外显子14跳跃的可变剪接事件会激活MET-HGF通路，促进肿瘤细胞增殖、迁移，并阻止细胞凋亡（图1b）。
替泊替尼对 MET 外显子 14 跳跃突变 NSCLC 软脑膜转移患者的疗效及生物利用度
患者，男性，56岁，2019年8月因胸部X光片示右上肺异常阴影来我院（日本弘前大学医院）就诊。患者吸烟史50包年，但病史无异常，未服用任何药物。对右上肺主要病变进行支气管肺活检。病理诊断为肺腺癌（cT3N2M0，第8版肺癌TNM分类IIIA期）。未检测到EGFR突变和ALK融合基因。根据弘前大学医院肿瘤科的决定，患者于2019年9月接受了右肺全肺切除术。但2019年10月的术后随访使用计算机断层扫描（CT）发现左侧大脑脑转移，为此患者接受了立体定向放射外科治疗，并于2019年11月至2020年4月连续4个周期的顺铂（75 mg / m 2 ）和培美曲塞（500 mg / m 2 ）治疗，并以培美曲塞（500 mg / m 2 ）作为一线化疗进行维持治疗。从诊断到最后一次随访（2020年10月29日）的治疗过程如图1所示。
通过整个外显子组测序的肺癌患者对原发性肿瘤和配对脑转移的比较基因组分析：一项初步研究
肺癌脑转移（BMS）频繁进行，尽管对肺癌生物学有了更好的了解和靶向疗法的发展，但仍与预后不良有关。 颅内对全身治疗的不合理反应部分是由于原发性肺肿瘤（PLT）和BMS之间的肿瘤异质性。 因此，需要更好地了解肺癌BMS生物学，以改善这些患者的治疗策略。 我们对配对BM和PLT样品的整个外显子组测序进行了研究。 BM样品中的体细胞变体和染色体改变的数量较高。 我们确定了在PLT中未发现的BMS中的复发突变。 系统发明树和棒棒糖图旨在描述它们的功能影响。 在≥1bm中突变的13个基因中，先前描述的7个与入侵过程有关，其中3个在功能域中复发突变的3个可能是治疗的未来靶标。 我们提供了有关导致BMS的机制的一些见解。 我们发现13个基因的BM样品中的复发突变。 在这些基因中，以前被描述为与癌症有关，其中3个（CCDC178，RUNX1T1，MUC2）被描述为与转移过程有关。肺癌脑转移（BMS）频繁进行，尽管对肺癌生物学有了更好的了解和靶向疗法的发展，但仍与预后不良有关。颅内对全身治疗的不合理反应部分是由于原发性肺肿瘤（PLT）和BMS之间的肿瘤异质性。因此，需要更好地了解肺癌BMS生物学，以改善这些患者的治疗策略。我们对配对BM和PLT样品的整个外显子组测序进行了研究。BM样品中的体细胞变体和染色体改变的数量较高。我们确定了在PLT中未发现的BMS中的复发突变。系统发明树和棒棒糖图旨在描述它们的功能影响。在≥1bm中突变的13个基因中，先前描述的7个与入侵过程有关，其中3个在功能域中复发突变的3个可能是治疗的未来靶标。我们提供了有关导致BMS的机制的一些见解。我们发现13个基因的BM样品中的复发突变。在这些基因中，以前被描述为与癌症有关，其中3个（CCDC178，RUNX1T1，MUC2）被描述为与转移过程有关。
泛癌药物遗传学：靶向测序面板还是外显子组测序？
目的：本研究帮助临床医生和研究人员在泛癌症药物遗传学背景下在当前市售的靶向测序面板和外显子组测序面板之间做出明智的选择。材料和方法：研究了九种当代市售的靶向泛癌症面板和 xGen Exome Research Panel v2，以确定它们在多大程度上覆盖了五个现有癌症知识库中的药物遗传学变体-药物相互作用以及癌症基因组图谱中的驱动突变和融合基因。结果：xGen Exome Research Panel v2 和 True-Sight Oncology 500 分别针对现有知识库中 71.0% 和 68.9% 的药物遗传学相互作用；以及癌症基因组图谱中 93.7% 和 86.0% 的驱动突变。所有其他研究面板的目标百分比都较低。结论：在涵盖的癌症药物遗传学变异-药物相互作用和药物遗传学癌症变异方面，外显子组测序优于泛癌症靶向测序组。
von Hippellindau疾病肿瘤患者的VHL基因的新E1'神秘外显子中的原始研究生殖线突变或W
摘要背景是von Hippel-Lindau（VHL）疾病患者的新发现的VHL基因的生殖线突变的发生率以及尚不清楚paragangliomamoma或pheocholomopytomamoma（PPGL）的患者。方法我们研究了一个大型国际多中心队列，由1167例患者进行了阴性基因检测。Germline DNA from 75 patients with a single tumour of the VHL spectrum ('Single VHL tumour' cohort), 70 patients with multiple tumours of the VHL spectrum ('Multiple VHL tumours' cohort), 76 patients with a VHL disease as described in the literature ('VHL-like' cohort) and 946 patients with a PPGL were screened for E1' genetic variants.在12例患者中检测到E1中的六种不同的遗传变异。两个被归类为致病性，3个为未知意义的变体，1个变体为良性。在7名无关患者中发现了RS139622356，但在基因组聚集数据库的31例患者中只有16名患者（p <0.0001）中描述了这种变体可能是复发突变，或者可能是一种修饰剂突变，或者赋予了VHL Empscer肿瘤和癌症的风险。结论VHL E1'隐秘外显子突变贡献了1.32％（1/76）的“ VHL-like”队列，至0.11％（1/946）的PPGL队列，并应在VHL临床疑问的患者中进行筛选，并添加到下一代序列测试（NGS）的临床疑问中。我们的数据突出了研究在深内含子序列中鉴定的变体的重要性，这些变体仅通过检查基因/外部的编码序列而遗漏。通过将全基因组测序实施到临床实践中，可能会更频繁地检测和研究这些变体。
非小细胞肺癌中的 EGFR 外显子 20 插入突变
其结构主要由胞外区、跨膜区和胞内酪氨酸激酶结构域三部分组成。EGFR基因全长192kbp，由28个外显子组成，位于7号染色体短臂7p21-14区域。大多数突变发生在18～21外显子，不同类型的突变对EGFR TKI临床疗效的影响不同。外显子19的缺失和外显子21的L858R替换是EGFR最常见的两种突变，且对TKI敏感。EGFR Ex20Ins突变是第三种最典型的EGFR突变类型，已知其与吉非替尼、厄洛替尼等常见TKI耐药有关。目前，EGFR外显子20插入突变类型共122种，位于C螺旋后的Met766-Cys775，少数位于C螺旋后的G1u762-Tyr764。其中20.5%的插入发生在Val769位氨基酸之后，28.7%的插入发生在Asp770位氨基酸之后，17.2%的插入发生在Pro772位氨基酸之后，14%的插入发生在His773位氨基酸之后（5）。最常见的突变类型为Asp770_Asn771ins，其次为Va1769_Asp770ins、Asp770_Asn771ins、A1a767_Va1769、Va1769_Asp770ins和Ser768_Asp770，其插入序列基本相似。 EGFR Ex20Ins 是一个高度异质性的激活突变家族，其分子结构、生物学特性和对 EGFR TKI 的反应存在复杂的差异。对 EGFR 外显子 20 突变进行了分析
在突变小鼠品系中，基因通过跳过外显子重新启动转录和翻译，从而超越基因靶向策略
小鼠胚胎干细胞或受精卵中的基因破坏是鉴定体内基因功能的传统遗传学方法。然而，由于不同的基因破坏策略使用不同的机制来破坏基因，这些策略可能导致所得小鼠模型出现不同的表型。为了确定不同的基因破坏策略是否会影响所得突变小鼠的表型，我们对通过三种常用策略（确定性敲除 (KO) 优先和 CRISPR/Cas9）产生的 Rhbdf1 小鼠突变株进行了表征。我们发现 Rhbdf1 对不同的 KO 策略的反应不同，例如，通过跳过外显子并重新启动翻译来潜在地产生获得功能的等位基因，而不是预期的无效或严重的次等位基因。我们的分析还显示，使用 KO 优先策略产生的小鼠中至少有 4% 表现出相互冲突的表型，这表明外显子跳过是整个基因组中普遍存在的现象。此外，我们的研究强调，至少 35% 的小鼠和 45% 的人类蛋白质编码基因可能易于发生靶向 KO 优先和 CRISPR/Cas9 介导的意外翻译。我们的研究结果对基因组编辑在基础研究和临床实践中的应用具有重要意义。简介小鼠在基因上与人类密切相关，因此选择小鼠作为模型系统来破译约 20,000 个蛋白质编码基因的功能，以深入了解人类生物学和疾病。对于大规模小鼠诱变工作，通过小鼠胚胎干 (ES) 细胞中的同源重组进行基因靶向是一种有效且通用的技术。基因靶向涉及确定性无效设计（删除目标基因的整个基因组序列）或靶向敲除 (KO) 优先设计，这提供了多种优势，包括基因破坏和报告标记突变，此外，还允许以组织特异性或时间方式分析基因功能。最近，使用 CRISPR/Cas9 直接破坏受精卵中的基因已经取代了确定性无效和 KO-first 策略。为了确定不同的基因靶向策略是否会影响纯合突变小鼠的表型，我们系统地表征了由这三种 KO 策略（确定性无效、靶向 KO-first 和 CRISPR/Cas9）产生的 Rhbdf1 突变小鼠。Rhbdf1 基因编码 RHBDF1，并被认为在生长发育 [1]、炎症 [2] 和癌症 [3-5] 中起关键作用。确定性无效和靶向 KO-first 策略是强大的高通量方法，可用于 ES 细胞中的大规模基因靶向，以研究数千种哺乳动物蛋白质编码基因，从而更好地了解人类生物学和疾病 [6-8]。在使用确定性无效策略时，基于细菌人工染色体 (BAC) 的打靶载体替换靶基因的整个基因组序列 (补充图 1a)，从而产生无效等位基因。相比之下，靶向 KO-first 方法 [9, 10] 是一种包括可根据所需结果选择的替代步骤的策略，具有高度的通用性，