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World File Search System定向进化
创造遗传多样性：释放蛋白质进化的潜力
摘要：遗传多样性是生物体进化复原力、适应潜力和旺盛生命力的基础，是生态系统健全和地球生命不断进化的基石。定向进化是一种受自然进化过程启发的强大生物技术工具，在产生遗传多样性的创新策略的推动下，定向进化格局发生了变革性的变化。这种转变受到多种因素的推动，包括使用 CRISPR-Cas 和碱基编辑器等先进工具包、对生物机制的理解加深、具有成本效益的定制寡核苷酸池合成以及人工智能与自动化的无缝集成。这篇全面的综述研究了用于构建体外和体内基因文库的各种方法，分为三大类：随机诱变、聚焦诱变和 DNA 重组。本综述的目的有三：首先，全景概述遗传多样性创造的最新进展；其次，激发遗传多样性生成的进一步创新新思路；第三，为进入定向进化领域的个人提供宝贵的资源。
具有 Cys-His-Asp 三联体的无金属 α/β-水解酶的超高通量定向进化为高效的磷酸三酯酶
摘要：寻找新的机制解决方案以应对生物催化挑战是酶进化适应以及设计新催化剂的关键。最近人造物质被释放到环境中，为观察生物催化创新提供了动态试验场。用作杀虫剂的磷酸三酯最近才被引入环境中，而它们并没有天然对应物。为了应对这一挑战，酶已迅速进化以水解磷酸三酯，并趋向于相同的机制解决方案，即需要二价阳离子作为催化的辅助因子。相比之下，先前发现的宏基因组混杂水解酶 P91（乙酰胆碱酯酶的同源物）实现了由金属独立的 Cys-His-Asp 三联体介导的缓慢磷酸三酯水解。在这里，我们通过对 P91 进行定向进化来探究这种新催化基序的可进化性。通过将聚焦库方法与液滴微流体的超高通量相结合，我们仅通过两轮进化就将 P91 的活性提高了约 360 倍（达到 ak cat / KM ≈ 7 × 10 5 M − 1 s − 1 ），可与自然进化的金属依赖性磷酸三酯酶的催化效率相媲美。与其同源物乙酰胆碱酯酶不同，P91 不会遭受自杀抑制；相反，快速的去磷酸化速率使共价加合物的形成而不是水解速率成为限制因素。定向进化改进了这一步骤，中间体的形成速度提高了 2 个数量级。将聚焦的组合库与液滴微流体的超高通量相结合，可以用于识别和增强自然界中尚未达到高效率的机制策略，从而产生具有新型催化机制的替代试剂。■ 简介
通过无标记质谱筛选定向进化具有新活性的环二肽合酶
我们和其他人最近开发了一系列高通量 MS 筛选方法，用于定向蛋白质进化。13 – 16 然而，MS 的无标记优势尚未在设计新的酶活性中得到充分体现，这可能是因为非靶向 MS 筛选存在困难。特别是，它需要仔细标准化和优化样品制备、MS 采集和数据处理，这对于最大限度地减少实验噪音和发现新产品的微弱信号是必不可少的。另一方面，生物铸造厂提供了一种新兴的基础设施，通过机器人标准化和并行化来协助生物工程中的设计 – 构建 – 测试 – 学习 (DBTL) 循环。17 – 19 使用集成生物铸造厂，我们在此报告了一种重组文库的无标记 MS 筛选工作流程，以快速分离催化新产品形成的酶突变体。这种新的工作流程将我们之前的基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI-ToF) MS 的筛选方法从琼脂菌落 16 扩展到行业标准微孔板中的液体培养物，以获得更好的均匀性。与菌落不同
利用 TadA 的下一代胞嘧啶碱基编辑器
• 脱氨酶的定向进化 • PAM 变体碱基编辑器 • 定向进化 Cas9 以创建用于 BE 的非 NGG PAM 变体 • 密码子、NLS 和接头优化 • 环状置换体和镶嵌碱基编辑器 • DNA 脱靶评估 • RNA 脱靶评估 • 旁观者编辑最小化 • 引导 RNA 工程 • 离体和体内 BE 递送 • 最小化脱靶活性的工程 BE • HSC、肝细胞和 T 细胞的离体碱基编辑 • ABE 的低温电子显微镜结构 • 小鼠体内碱基编辑 • 非人类灵长类动物体内编辑
在哺乳动物细胞中细菌亮氨酸tRNA的定向进化，以增强非规范氨基酸诱变
图2。tRNA leu库设计和下一代测序选择数据。a）受体茎的序列对齐的WEBLOGO表示来自682个细菌trNA，表明每个位置在每个位置的每个残基相对丰度。编号方案相对于tRNA ecleu（面板b）。b）野生型大肠杆菌tRNA cuA leu的三叶草结构，通过随机使受体词干碱基对随机使图书馆生成方案。基础配对均通过根据框中显示的彩色方案在每个位置引入每个位置的成对替换来维护。随机化被限制以维持保守的序列元素（面板A）。c）在选择之后和之前，使用其在文库中的标准化丰度（以前/以前/丰度）在库中测量了库中每个突变体在库中的富集。进行了选择的两种生物学重复，并彼此绘制了这两种重复物中观察到的每个突变体的富集。d）显示了最高1％（最丰富）序列的共识序列。提供了WT-TRNA ecleu的序列作为参考。e）在存在或不存在1 mM帽的情况下，通过将每个tRNA ecleu突变体的活性与PLRS1和EGFP-39TAG一起转染中，与PLRS1和EGFP-39TAG进行了测试（另请参见图S5）。在无细胞提取物中测量了EGFP-39TAG的表达，
在不同组合景观中对机器学习辅助定向进化的评估
2 加州理工学院化学与化学工程部，加利福尼亚州帕萨迪纳 91125，美国 3 加州理工学院工程与应用科学部，加利福尼亚州帕萨迪纳 91125，美国 4 现地址：默克公司，南旧金山，加利福尼亚州 94080 5 现地址：苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系，Schanzenstrasse 44，4056 Basel 6 主要联系人* 通讯作者：Frances H. Arnold，frances@cheme.caltech.edu Yisong Yue，yyue@caltech.edu 摘要 各种机器学习辅助定向进化 (MLDE) 策略已被证明能比典型的湿实验室定向进化方法更有效地识别高适应度蛋白质变体。然而，对影响 MLDE 在不同蛋白质中表现的因素的了解有限，阻碍了湿实验室活动的最佳策略选择。为了解决这个问题，我们系统地分析了多种 MLDE 策略，包括使用六种不同的零样本预测因子的主动学习和集中训练，涵盖 16 种不同的蛋白质适应度景观。通过用六个属性量化景观导航能力，我们发现 MLDE 在定向进化更具挑战性的景观上提供了更大的优势，尤其是当集中训练与主动学习相结合时。尽管不同景观的优势程度各不相同，但利用不同的进化、结构和稳定性知识来源的零样本预测因子的集中训练在结合相互作用和酶活性方面始终优于随机采样。我们的研究结果为选择蛋白质工程的 MLDE 策略提供了实用指南。关键词组合诱变、定向进化、上位性、适应度预测、机器学习、蛋白质工程、零样本预测因子
定向进化 Methanomethylophilus alvus 吡咯氨酰-tRNA 合成酶可产生高活性和高选择性变体
吡咯赖氨酸-tRNA 合成酶（PylRS）通常用于将非规范氨基酸（ncAA）位点特异性掺入蛋白质中。最近，Methanomethylophilus alvus PylRS（Ma PylRS）的活性位点经过合理设计，以扩大其底物兼容性，从而能够掺入难以结合的 ncAA。然而，尚未报道活性位点以外的可增强 Ma PylRS 酶特性的突变。我们利用噬菌体辅助非连续进化（PANCE）来进化 Ma PylRS，以有效掺入 N ε -Boc- L -赖氨酸（BocK）。定向进化产生了活性位点外的几种突变，这些突变大大提高了酶的活性。我们结合最有效的突变来生成一种新的 PylRS 变体（PylRS opt），它对几种赖氨酸和苯丙氨酸衍生物具有高活性和选择性。 PylRS opt 中的突变可用于增强先前设计的 PylRS 构建体，例如 Ma PylRS N166S，并且 PylRS opt 适用于需要双 ncAA 掺入的应用，并可显著提高这些目标蛋白的产量。
定向进化驱动的结构可塑性增加是结合补体凝集素途径阻断 MASP 抑制剂肽的先决条件
摘要：MASP-1 和 MASP-2 是补体凝集素途径的关键激活蛋白酶。第一种特异性甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶 (MASP) 抑制剂已通过噬菌体展示从 14 个氨基酸向日葵胰蛋白酶抑制剂 (SFTI) 肽开发出来，产生了基于 SFTI 的 MASP 抑制剂 SFMI。在这里，我们展示了我们分析的 MASP-1/SFMI1 复合物的晶体结构，并将其与其他现有的 MASP-1/2 结构进行了比较。刚性骨架结构长期以来一直被认为是蛋白酶肽抑制剂的结构先决条件。我们发现围绕 P2 Thr 残基组织的疏水簇对于野生型 SFTI 的结构稳定性至关重要。我们还发现，相同的 P2 Thr 可阻止刚性 SFTI 样肽与两种 MASP 的底物结合裂隙结合，因为裂隙被大型守门酶环部分阻断。定向进化通过将 P2 Thr 替换为 Ser 消除了这一障碍，为 SFMI 提供了高度的结构可塑性，这对 MASP 抑制至关重要。为了更深入地了解基于 SFMI 的 MASP-2 抑制的结构标准，我们系统地修改了 MASP-2 特异性 SFMI2，方法是封端其两个末端并用不同长度的硫醚接头替换其二硫键。通过这样做，我们还旨在生成一种多功能支架，该支架可抵抗还原环境并在含有外肽酶的生物环境中具有更高的稳定性。我们发现，抗还原的二硫键取代的 L-2,3-二氨基丙酸 (Dap) 变体具有接近天然的效力。由于 MASP-2 与 COVID-19 患者危及生命的血栓形成有关，我们的合成、选择性 MASP-2 抑制剂可能成为相关的冠状病毒候选药物。■ 简介
走廊中的海报演示（有关详细信息，请参见下文）
可靠的tRNA签名分析：用于早期诊断非小细胞肺癌早期诊断的新型液体活检1:15 min seok han探索方法，用于piggybac transposase的定向进化1:30海顿·霍尔蒙德（Hayden Holmlund