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World File Search System定向进化
通过定向进化和计算建模构建富含 sp3 的多环化合物的生物催化策略
在 MD 轨迹中，分子重新定向，使得噻吩环位于血红素环 C 上方（1a 中为环 B），并且甲氧基的极性氧原子指向溶剂（图 6c）。相反，使用 6Me 取代的底物（2j）的 MD 模拟显示苯并噻吩环深深嵌入酶口袋中并远离溶剂（图 6c），其构象与底物 1a 和 5-OMe 底物不同。通过实验，酶对这些底物的活性遵循 2f（5-OMe）> 1a> 2j（6-Me）的顺序（图 3a）。由于该趋势与 MD 模拟确定的相应 TS 中苯并噻吩环对溶剂的暴露程度相关，我们假设底物
利用随机多路复用 sgRNA 组装碱基编辑器进行定向进化水稻基因
摘要 基于 CRISPR 的定向进化是一种有效的育种生物技术，可改善植物的农艺性状。然而，使用单个单向导 RNA 其基因多样化仍然有限。我们在这里描述了一种多重正交碱基编辑器 (MoBE) 和一种随机多重 sgRNA 组装策略，以最大化基因多样化。MoBE 可以在不同的靶标上有效诱导正交 ABE (< 36.6%)、CBE (< 36.0%) 和 A&CBE (< 37.6%)，而 sgRNA 组装策略将各种靶标上的碱基编辑事件随机化。对于水稻乙酰辅酶 A 羧化酶 (OsACC) 第 34 外显子的每一条链上的 130 个和 84 个靶标，我们在随机双 sgRNA 和随机三重 sgRNA 文库中观察到多达 27 294 种靶标-支架组合类型。我们进一步利用MoBE和随机双sgRNA文库对水稻中的OsACC进行了定向进化，获得了更强的除草剂抗性的单突变或连锁突变。这些策略可用于功能基因的原位定向进化，并可能加速水稻性状改良。
1 EnzyHTP 计算定向进化与...
摘要：定向进化通过迭代诱变促进酶工程。尽管高通量筛选应用广泛，但构建“智能库”以有效识别有益变体仍然是该社区面临的主要挑战。在这里，我们基于 EnzyHTP 开发了一种新的计算定向进化协议，EnzyHTP 是我们之前报道过的用于自动化酶建模的软件。为了提高吞吐效率，我们实施了一种自适应资源分配策略，该策略根据工作流中酶建模子任务的特定需求动态分配不同类型的计算资源（例如 GPU/CPU）。我们将该策略实现为 Python 库，并使用氟乙酸脱卤酶作为模型酶测试了该库。结果表明，与在整个工作流中 CPU 和 GPU 都随时可用的固定资源分配相比，应用自适应资源分配可以节省 87% 的 CPU 小时数和 14% 的 GPU 小时数。此外，我们在自适应资源分配框架下构建了一个计算定向进化协议。该工作流程在 Kemp 消除酶定向进化实验中针对两轮突变筛选进行了测试，总共有 184 个突变体。使用折叠稳定性和静电稳定能作为计算读数，我们重现了四个实验观察到的目标变体中的三个。借助该工作流程，整个计算任务（即 18.4 μs MD 和 18,400 QM 单点计算）在三天内使用约 30 个 GPU 和约 1000 个 CPU 完成。
通过人工智能引导的定向进化筛选创建对病毒具有高亲和力的 ACE2 突变体
2. Ikemura N、Taminishi S、Inaba T、Arimori T、Motooka D、Katoh K、Kirita Y、Higuchi Y、Li S、Suzuki T、Itoh Y、Ozaki Y、
基于活动的哺乳动物细胞膜编辑器的定向进化
细胞膜含有多种脂质，由于缺乏原位控制调节膜组成的方法，人们对于单个脂质生物学功能的了解一直受到阻碍。在这里，我们提出了一种编辑磷脂的策略，磷脂是生物膜中最丰富的脂质。我们的膜编辑器基于细菌磷脂酶 D (PLD)，它通过水或外源醇对磷脂酰胆碱进行水解或转磷脂酰化来交换磷脂头部基团。利用哺乳动物细胞中活性依赖性的定向酶进化，我们开发并从结构上表征了一个“超级PLD”家族，其活性比野生型 PLD 高 100 倍。我们证明了超级PLD 在活细胞中特定细胞器膜内光遗传学编辑磷脂以及体外生物催化合成天然和非天然设计磷脂的实用性。除了超级PLD之外，哺乳动物细胞中基于活动的定向酶进化是一种可推广的方法，可以设计出额外的化学酶生物分子编辑器。
通过无标记质谱筛选定向进化具有新活性的环二肽合酶
我们和其他人最近开发了一系列高通量 MS 筛选方法，用于定向蛋白质进化。13 – 16 然而，MS 的无标记优势尚未在设计新的酶活性中得到充分体现，这可能是因为非靶向 MS 筛选存在困难。特别是，它需要仔细标准化和优化样品制备、MS 采集和数据处理，这对于最大限度地减少实验噪音和发现新产品的微弱信号是必不可少的。另一方面，生物铸造厂提供了一种新兴的基础设施，通过机器人标准化和并行化来协助生物工程中的设计 – 构建 – 测试 – 学习 (DBTL) 循环。17 – 19 使用集成生物铸造厂，我们在此报告了一种重组文库的无标记 MS 筛选工作流程，以快速分离催化新产品形成的酶突变体。这种新的工作流程将我们之前的基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI-ToF) MS 的筛选方法从琼脂菌落 16 扩展到行业标准微孔板中的液体培养物，以获得更好的均匀性。与菌落不同
集群学习辅助定向进化
其中 x 是序列，f(x) 是未知的序列到适应度图。DE 是一种黑盒优化问题，它按顺序查询序列进行实验筛选。贪婪搜索能够有效地用最少的实验找到改进的序列，但由于适应度景观中普遍存在的上位性，它通常仅限于探索局部最优 2 – 4 。另一方面，通过多位点饱和诱变进行随机探索不可避免地会产生庞大的组合文库，这往往会超出筛选能力 5 。一种以最小的实验负担搜索上位性景观的有效策略是十分可取的。过去十年，生物数据的机器学习 (ML)（包括深度学习，DL）算法得到了快速发展 6 – 10 。监督模型可以学习蛋白质与适应度之间的关系，并提供酶活性和选择性3、蛋白质热稳定性11、蛋白质折叠能12、13、蛋白质溶解度14、蛋白质-配体结合亲和力15和蛋白质-蛋白质结合亲和力16的定量预测。由于获取监督标签的成本高昂，自监督蛋白质嵌入已成为蛋白质建模的重要范例。通过对自然进化产生的大量未标记序列数据进行训练，自监督蛋白质嵌入可以捕获序列中大量潜在的生物信息，并将信息传递给下游的监督任务17、18。许多模型架构（如变分
酵母基因组定向进化的最新进展
摘要：酿酒酵母作为一种公认安全 (GRAS) 真菌，已成为工业应用和基础研究中最广泛使用的底盘细胞之一。然而，由于其复杂的遗传背景和相互交织的代谢网络，仍然有许多障碍需要克服，以改善所需特性并成功地将基因型与表型联系起来。在此背景下，基因组编辑和进化技术在过去几十年中迅速发展，以促进快速产生定制特性以及精确确定调节生理功能的相关基因靶标，包括抗逆性、代谢途径优化和生物体适应性。定向基因组进化已成为一种多功能工具，使研究人员能够获得所需特性并研究日益复杂的现象。本文回顾了酿酒酵母定向基因组进化的发展，重点介绍了推动进化工程的不同技术。
1 TetR 型阻遏物的发散定向进化...
图 1 RolR 诱变、选择和半自动化高通量筛选工作流程。a. 全构象的 RolR 二聚体（PDB：3AQT），以及配体结合口袋的结构，其中残基 D149 为黑色，间苯二酚为青色，5Å 内选择用于诱变的 19 个残基为橙色，5Å 和 8Å 之间的残基为紫色。b. 组合活性位点饱和度测试 (CAST) 的笛卡尔结合口袋图。c. 六个氨基酸组组成了要用于诱变的 19 个残基。d. 生物传感器 TetA 双重选择的原理，使用 NiCl 2 对转录抑制能力进行负向选择，使用四环素对目标配体进行正向选择。e. 半自动化高通量筛选。在第 1 天，为每个候选分子挑选约 500 个菌落。第二天，使用声学液体处理器将 IPTG 和小分子分配到 384 孔板中。生长的菌落被稀释并分配到 384 个孔板中，使用液体处理工作站测试传感器的不同状态。第三天，荧光