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World File Search System定点诱变
一种改良的农杆菌介导的针对两种卵菌病原体的转化方法
卵菌是一类丝状微生物，其中包括对粮食安全和自然生态系统的最大威胁之一。然而，这些生物的致病机制和发育的大部分分子基础仍有待了解，这主要是由于缺乏有效的基因操作方法。在本研究中，我们开发了针对两种重要的卵菌物种 Phytophthora infestans 和 Plasmopara viticola 的改良转化方法，这两种物种给农业生产带来了毁灭性的损害。作为研究的一部分，我们通过在农杆菌中原核表达 AtVIP1（VirE2 相互作用蛋白 1）建立了一种改良的农杆菌介导转化 (AMT) 方法，AtVIP1 是拟南芥的一个 bZIP 基因，是 AMT 所必需的，但在卵菌基因组中不存在。使用新方法，我们提高了两种 P . infestans 菌株的转化效率。我们进一步使用改良的 AMT 方法获得了 P . viticola 的阳性 GFP 转化子。通过将此方法与 CRISPR/Cas12a 基因组编辑系统相结合，我们成功进行定点诱变，并在两个马铃薯致病疫霉基因中产生了功能丧失的突变。我们编辑了一个 MADS-box 转录因子编码基因，发现 MADS-box 的纯合突变导致孢子形成不良和毒力显著降低。同时，我们针对马铃薯致病疫霉中单拷贝无毒力效应基因 Avr8 进行了定点突变，编辑后的转化子对携带同源抗性基因 R8 的马铃薯具有毒性，这表明 Avr8 的缺失导致病原体成功逃避宿主的免疫反应。总之，本研究报告了一种改进的遗传转化和基因组编辑系统，为加速卵菌和其他微生物的分子遗传学研究提供了一种潜在的工具。
抑制 EML4-ALK 细胞模型中的抗凋亡蛋白 BCL2 是治疗非小细胞肺癌的第二个拟议靶点
间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 癌蛋白通过组成性磷酸化激活与细胞增殖和存活相关的信号通路，在非小细胞肺癌 (NSCLC) 中发挥关键作用。虽然一线克唑替尼可以调节磷酸化，但 ALK 基因突变可能导致对 ALK 抑制剂 (ALKi)（如色瑞替尼和阿来替尼）产生耐药性。另一方面，在 NSCLC 中观察到参与细胞死亡调节的蛋白质 BCL2 过度表达，被认为是潜在的治疗靶点。在本研究中，我们建议在 EML4-ALK 细胞模型中抑制 BCL2 作为次要治疗靶点，以克服 ALK 突变引起的耐药性。通过定点诱变产生的四种 Ba/F3 EML4-ALK 细胞模型 (WT、C1156Y、L1196M 和 G1202R) 表现出不同程度的 BCL2 表达。WT 和 G1202R 模型均显示 BCL2 过度表达，而 C1156Y 和 L1196M 模型接近基线水平。我们用选择性 BCL2 抑制剂 ABT-199 处理这些细胞，发现 BCL2 表达高的模型表现出抗性，而表达较低的模型对 BCL2 抑制表现出敏感性。此外，我们使用生物信息学分析表明 ABT-199 不仅靶向 BCL2，而且还与所有 ALK 突变体的活性位点结合，这与 ABT-199 (5.5 μ M) 在体外对 ALK 激酶活性的抑制形成对比。 300nM ABT-199 单独治疗和联合治疗均显著降低了 ALK 磷酸化，这进一步证实了这种相互作用。最后，当 ABT-199 与 ALKi 结合时，我们在 WT 和 G1202R 细胞模型中观察到了广泛的协同作用，而 C1156Y 和 L1196M 模型中表现出有限的协同作用。总之，我们的研究结果表明，ABT-199 与 ALKi 联合靶向 BCL2 可显著降低 Ba/F3 EML4-ALK 细胞模型中的肿瘤细胞存活率。
转基因生物：牛津疫苗组（20...
B2 与申请有关的转基因生物的一般描述 GMO 的描述 GMO 是野生型副伤寒沙门氏菌 (S. Paratyphi) A 9150 菌株的同源突变体。遗传改造的目的是构建一种带有 guaBA 操纵子和 clpX 基因缺失的改良 S. Paratyphi A 9150 菌株，以产生生长缺陷的减毒 S. Paratyphi A 菌株 (CVD 1902)。GMO (CVD 1902) 将用于研究其作为减毒活口服疫苗在受控人类感染模型中预防肠热病的价值。CVD 1902 副伤寒沙门氏菌 A 血清型活口服疫苗是由野生型亲本菌株 S. Paratyphi A 9150 构建的。使用改良的 Lambda Red 介导的定点诱变程序进行缺失。删除了两个基因序列：guaBA 染色体操纵子（编码远端从头鸟嘌呤核苷酸生物合成途径中使用的两种酶）和 clpX 基因（编码分子伴侣 ATPase，与 clpP 编码的丝氨酸蛋白酶一起发挥作用，形成参与各种代谢过程的复合物）。clpX 缺失突变的表型后果之一是鞭毛的过度表达，这也可能增强 GMO 菌株的免疫原性，因此有助于其作为减毒活疫苗的适用性。从研究中获得的信息将用于指导疫苗设计和开发，从而可能影响公共卫生干预策略。应用描述在这项临床研究中，我们建议调查 GMO CVD 1902 作为减毒活疫苗在 S. Paratyphi A 人类攻击模型中预防副伤寒感染的有效性。使用野生型 S 的 S. Paratyphi A 感染的人感染模型。副伤寒甲型（NVGH308 株）已在牛津疫苗组（英国牛津大学）建立。牛津疫苗组（英国牛津大学）一直在进行
课程名称：基因工程与重组DNA技术原理 课程代码：BBP 155 学分数：3 LTP：30-15-0 学时
课程协调员：Anandita Singh 教授 课程讲师：Anandita Singh 教授 联系方式：asingh@terisas.ac.in 课程类型：核心 课程开课时间：第 1 学期 课程描述：通过跨越生物体边界的遗传元素精确重组来遗传操作和设计基因组序列的能力是生物技术的核心。这门基础核心课程专为有兴趣开发基因工程方法概念框架和技术诀窍的学生而设计。成功完成本课程后，学生将深入了解基因操作原理，并认识到基因工程在推动多个生物技术分支研发方面的核心作用。学生将熟练掌握用于分离、操作和新颖设计基因组序列的技术的创造性部署。我们将介绍一般 DNA 修饰酶的特性及其应用。例如，我们将在热稳定聚合酶的背景下讨论 PCR 的概念化、创新、进化和应用方面。本课程将介绍新时代突变技术和基因组工程研究中隐含的多功能和非典型修饰酶，包括非特异性内切酶。克隆策略将与载体类别和应用相关，例如植物转化、蛋白质表达、基因组和 cDNA 文库构建等。本课程将说明宿主特异性和选择与筛选策略的设计。本课程将教授克隆基因组片段的定点诱变方法。本课程将不涉及分子生物学的基本和高级分析技术。为了确保对当代工具的覆盖范围和足够的深度，本课程有意避免使用不再使用的过时方法。但是，学生将了解历史信息，以说明当代生物学研究中使用的程序的演变。最后，本课程将介绍用于 DNA 序列的计算机注释和操作的软件，以便有效地设计、跟踪和管理实验室中的克隆实验。课程目标：1. 培养对基础知识在发现和创新中的重要性的认识
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构