‡ 通信地址:aashiq.kachroo@concordia.ca 关键词:基因组工程、CRISPR-Cas9、人源化酵母、蛋白酶体 缩写:CFU、菌落形成单位;DSB、双链断裂;HDR、同源定向 DNA 修复;HR、同源重组;CELECT、基于 CRISPR-Cas9 的选择以丰富基因型;MERGE、无标记富集和重组基因工程位点;SGA、合成遗传阵列
图 2 富集具有低细胞表面岩藻糖基化的细胞。(A)Fut8 和对照池以及富集池和克隆的 AAL-FITC 染色。仅对生成的三个对照池和 Fut8 池中的一个进行染色并用于进一步富集。每个组中选择用于进一步评估的克隆都标有星号(参见图 S3 中仅选定的克隆)。(B)对来自 a) 的 FITC 信号的 MFI 进行量化。点表示每个染色池或克隆的测量值。(C)对对照和 Fut8 池以及在 6 天批次中培养的选定富集池和克隆中的 Fut8 基因表达进行 qPCR 量化。所有三个未富集的对照和 Fut8 池都进行了培养。点表示池(条 1、2、4、5)或单个克隆(3 和 6)的生物学重复。误差线表示池或单个克隆的生物学重复的 SEM。使用非配对 t 检验来计算对照和 Fut8 富集克隆之间的统计学意义
图 1. 供体 DNA 模板设计。TrueTag 供体 DNA 试剂盒提供用于 (A) N 端标记或 (B) C 端标记目标基因的 PCR 模板。具有短同源臂 (HA) 序列的位点特异性引物用于 PCR 扩增以生成供体 DNA 分子。通过 CRISPR-Cas9 或 TALEN ™ 系统切割目标位点后,供体 DNA 在 HDR 过程中整合到基因组中。2A 自切割肽 (2A) 允许选择标记 (嘌呤霉素或杀稻瘟素) 和标记基因从内源启动子表达。每个模板的通用引发序列 (Uni) 允许轻松设计 PCR 引物。
摘要 Prime editing 是一种最近开发的基于 CRISPR/Cas9 的基因工程工具,可用于在基因组中引入短插入、删除和替换。然而,Prime edit 的编辑率通常约为 10%–30%,效率却与其多功能性不符。本文,我们介绍了 Prime editor 活性报告基因 (PEAR),这是一种灵敏的荧光工具,可用于识别具有 Prime edit 活性的单个细胞。PEAR 没有背景荧光,可特异性指示 Prime edit 事件。它的设计为整个间隔序列的序列变异提供了无限的灵活性,使其特别适合于系统地研究影响 Prime edit 活性的序列特征。使用 PEAR 作为 Prime edit 的富集标记可使编辑群体增加高达 84%,从而显著提高 Prime edit 在基础研究和生物技术应用中的适用性。
通过与人MBD2A蛋白的甲基-CPG结合结构域结合与人IgG1(MBD2A-FC的FC尾巴)的甲基-CPG结合结构域结合,将甲基化的DNA从碎片的基因组DNA(5 ng-25μg)中分离出来,该蛋白与人IgG1(MBD2A-FC)的FC尾部结合,从而与paramagnetic Hydophilic Protein a betein a bead a bead a bead a bead a bead a bead a bead a bead a bead a bead a。两个FC结构域可以与具有高亲和力的蛋白质A上的一个位点结合(K d = 10 –7)。由于FC片段是二聚体,因此四个MBD2结构域暴露于每个分子蛋白A分子的溶剂,从而增加了相对平衡常数100倍。这种稳定的复合物将选择性地结合含有DNA的双链甲基化的CpG。在简单的洗涤步骤随后进行磁捕获后,通过在65°C下孵育,富集的DNA样品很容易在少量无核酸酶的水中洗脱。样本可以立即通过多种方法进行下游分析,包括:
简单的摘要:重要的经济昆虫Bombyx Mori(B。Mori)以其丝绸而闻名。B.莫里丝主要由涂有丝网膜蛋白的丝绸纤维组成。其中,丝绸纤维重链蛋白具有最高的含量和最大的分子量,该蛋白质由丝绸烤重链(FIBH)基因编码。目前,除了B. mori菌株p50t的FIBH的完整序列外,还没有有关该蛋白质的其他报道。这主要是因为FIBH中富含GC的重复序列形成的特殊结构阻碍了聚合酶的扩增和Sanger测序的应用。在这里,通过首席执行官获得了与p50t相似的Dazao的FIBH序列,该序列具有99.98%的相似性。据我们所知,这是中国B. mori菌株的第一个完整的FIBH序列。此外,还确定了FIBH重复单元中的甲基化CG位点。
Twist Bioscience 文库制备和靶向富集检测是一种高度模块化的靶向富集下一代测序 (NGS) 试剂盒,具有从固定面板到全外显子组测序的各种应用。该试剂盒利用基因组 DNA (gDNA) 的片段化、连接和扩增来制备 NGS 文库,并利用基于珠子的杂交文库捕获来富集文库。Twist Bioscience 为用户提供了高度的灵活性,以满足实验室的需求,包括酶促或机械片段化、使用 Twist 全长组合双 (CD) 索引适配器或通用双索引 (UDI) 引物的两组不同的索引化学反应、单重或多重富集选项、用于文库富集的市售固定面板和定制面板选项,以及“标准”16 小时杂交选项或可运行 15 分钟至 4 小时的“快速”杂交选项。整个手动文库制备和靶向富集方案可以在最短一天或最多三天内完成。
丰富的理论结果。已经设计了近距离的算法。[参见,例如AOM17,JABJ19]
摘要引入中等重度创伤性脑损伤(M-STBI)的人经历了脑部造成的脑部和行为下降。纵向研究发现,大多数M-STBI患者在伤害后5到12个月表现出显着的海马萎缩,与认知环境富集降低有关(EE)。令人鼓舞的是,参与EE已被证明会导致神经改善,这表明这是抵消M-STBI海马神经变性的有前途的途径。同种形式的空间导航(即,柔性,鸟类视图方法),是M-STBI中EE的良好候选者,因为它与海马激活和减少与年龄相关的体积损失减少有关。EE的功效需要在大多数当前的医疗服务系统中进行强化的日常培训。 目前的方案是一种新颖的,远程交付和自我管理的干预措施,旨在利用EE和中心空间导航,以抵消海马萎缩,并有可能改善M-STBI患者的海马功能,例如导航和记忆。 的方法和分析正在从城市康复医院招募八十四名参与者,并将其随机分为有针对性的空间导航或主动对照组的16周干预(5小时:80小时:80小时)。 空间导航小组使用包括日常导航挑战的Google街道视图对不同城市进行结构化探索。 主动对照组观看并回答有关教育视频的主观问题。EE的功效需要在大多数当前的医疗服务系统中进行强化的日常培训。目前的方案是一种新颖的,远程交付和自我管理的干预措施,旨在利用EE和中心空间导航,以抵消海马萎缩,并有可能改善M-STBI患者的海马功能,例如导航和记忆。的方法和分析正在从城市康复医院招募八十四名参与者,并将其随机分为有针对性的空间导航或主动对照组的16周干预(5小时:80小时:80小时)。空间导航小组使用包括日常导航挑战的Google街道视图对不同城市进行结构化探索。主动对照组观看并回答有关教育视频的主观问题。在短暂的方向上,参与者在自己的家用计算机上进行了远程自我管理。除了可行性和依从性措施外,还收集了干预前和干预后的临床和实验认知措施以及MRI扫描数据,以确定行为和神经功效。伦理和传播道德批准是从大学卫生网络和多伦多大学的道德委员会获得的。调查结果将在学术会议上提出,并提交给同行评审的期刊。
亚洲柑橘溃疡的病因,革兰氏阴性细菌xanthomonas citri subsp。citri(XAC)比Xanthomonas fuscans亚种产生更严重的症状并发作更多的cit宿主。aurantifolii Xaub和Xauc,肿瘤的病因,疾病的温和形式。在这里,我们报告了XAC和XAUB的富含周质的蛋白质组学分析XAM-M中的XAC和XAUB(一种致病性 - 诱导培养基),用于鉴定差异蛋白。蛋白质通过二维电泳与液相色谱 - 质量光谱法相结合。Among the 12 proteins identified from the 4 unique spots from XAC in XAM-M (p < 0.05) were phosphoglucomutase (PGM), enolase, xylose isomerase (XI), transglycosylase, NAD(P)H- dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase, succinyl-CoA synthetase β subunit, 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,以及保守的假设蛋白XAC0901和XAC0223;当两种细菌在NB培养基中生长,这是一种致病性的非诱导培养基时,它们中的大多数都没有被视为XAC的差异。XAUB与XAM-M中的XAC显示出截然不同的特征,其中呈现了29个独特的斑点,其中包含与各种代谢途径相关的蛋白质。通过蛋白质印迹分析在两种细菌的富含周质含量的馏分中,PGM和XI在XAC中的占主导地位得到了验证。
