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用于 AAV 递送的拆分金黄色葡萄球菌引物编辑器
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2021 年 1 月 11 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.01.11.426237 doi：bioRxiv preprint
补充表1。用于定量实时PCR的引物序列
havcr1（kim1）NM_001166632.1 ACA TAT CGT GGA ATC ACA ACG ACG AC AC AC AC ACT GCT CTT CTG CTG ATA GGT GAC A
植物引物编辑器实现水稻细胞的精准基因编辑
基因组编辑正在彻底改变植物研究和作物育种。序列特异性核酸酶 (SSN)，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 TAL 效应核酸酶 (TALEN)，已用于产生位点特异性 DNA 双链断裂并通过促进同源定向修复 (HDR) 实现精确的 DNA 修饰 (Steinert 等人，2016 年；Voytas，2013 年)。后来，RNA 引导的 SSN，例如 CRISPR-Cas9、Cas12a、Cas12b 及其变体，已应用于植物基因组编辑 (Li 等人，2013 年；Nekrasov 等人，2013 年；Tang 等人，2017 年；Zhong 等人，2019 年；Ming 等人，2020 年；Tang 等人，2019 年)。然而，HDR 依赖于 SSN 和 DNA 供体的同时递送，这在植物中一直具有挑战性（ Steinert 等，2016； Zhang 等，2019）。在植物中实现高效 HDR 的另一个挑战是，在大多数细胞类型中，DNA 修复倾向于非同源末端连接（NHEJ）途径而不是 HDR（ Puchta，2005； Qi 等，2013）。与受供体选择和 DNA 修复机制限制的 SSN 诱导的 HDR 不同，近年来开发的胞苷或腺嘌呤碱基编辑器可以在原型间隔物中 3-8 个核苷酸靶向窗口内将 C 转换为 T 或将 A 转换为 G（ Komor 等，2016； Nishida 等，2016； Gaudelli 等，2017）。碱基编辑器虽然效率很高，但只能指导某些转换突变，而不能执行预定的颠换突变或插入和缺失 (indel)。在所有这些背景下，最近在人类细胞中开发所谓的引物编辑器 (PE) 方面取得的突破非常令人兴奋 ( Anzalone 等人，2019 )。在引物编辑中，Cas9H840A 切口酶与逆转录酶融合。融合蛋白在编辑 DNA 链上切口，通过引导到切口 DNA 并复制由引物编辑向导 RNA (pegRNA) 编码的遗传信息来启动逆转录。多功能的 pegRNA 是一种经过修饰的单向导 RNA (sgRNA)，其 3' 端携带逆转录 (RT) 模板和引物结合位点 (PBS) 或序列中的引物。与 HDR 不同，PE 不需要 DNA 供体。在某些目标位点，PE 似乎也比碱基编辑器更精确、更高效（Anzalone 等人，2019 年）。
策划和验证普遍适用的引物，以有效地基于ITS2的DNA条形码
对植物物种的快速准确鉴定越来越多地寻求采用分子技术。ITS2区域在DNA条形码中高度评价，因为它的短长度和易于测序，使其成为物种识别的理想候选者。在这项研究中，通过对广泛植物分类群的底漆序列进行细致的分析和比较，我们策划了一系列具有证明普遍性的底漆，能够有效地扩大不同植物物种的ITS2区域。为了验证识别引物的普遍性，我们均采用了硅和体外方法。在计算机分析中涉及生物信息学工具，以评估公共数据库中可用的大量植物DNA序列的底漆结合位点。随后，使用从各种植物标本中提取的DNA样品进行了体外实验，以验证引物的扩增成功。通过这个全面的验证过程，我们确保了选定的引物用于DNA键编码目的的可靠性和适用性。我们发现的重要性在于使用ITS2区域建立了标准化的DNA栏编码方法，这有助于准确而有效的植物物种识别。通过为研究人员提供一组普遍适用的底漆，我们旨在简化底漆选择过程，从而减少实验设计所涉及的时间和精力。该标准化协议促进了DNA条形码研究中的一致性和可重复性，最终促进了我们对植物生物多样性的理解并有助于保护工作。
基于模拟群落评估中欧鱼类环境 DNA 条形码的五对引物
环境 DNA (eDNA) 宏条形码已成为检查鱼类群落的有力工具。在将基于 eDNA 的评估引入监管监测环境（例如欧盟水框架指令）之前，需要方法标准化。为了确保方法的准确性并满足监管标准，已经建立了各种采样、实验室和生物信息学工作流程。然而，全面监测鱼类的关键先决条件是选择合适的引物对，以准确识别给定水体中存在的鱼类。过去十年中，发表了针对不同遗传标记区域的各种鱼类特异性引物对。然而，尚未开展专门研究来评估常用鱼类引物对在评估中欧鱼类物种方面的性能。因此，我们创建了一个由 45 种中欧鱼类 DNA 组成的人工“模拟”群落，并检查了五对引物的检测能力和可重复性。我们的研究重点介绍了引物选择和生物信息学过滤对 eDNA 宏条形码结果的影响。在我们研究中评估的五对引物中，tele02（12S 基因）引物对是中欧淡水鱼 eDNA 元条形码的最佳选择。此外，MiFish-U（12S）和 SeaD NA-mid（COI）引物对表现出良好的检测能力和可重复性。然而，特异性较低的引物对（即针对脊椎动物）被发现不太可靠，并产生大量假阳性和假阴性检测。我们的研究说明了如何通过精心选择引物对和生物信息学流程使 eDNA 元条形码成为鱼类监测更可靠的工具。
具有不受束缚的逆转录酶和环状 RNA 模板的分裂引物编辑器
Es 可实现删除、插入和碱基替换而不会造成双链断裂 1 。然而，目前的 PE2、PE2* 和 PEmax 效应物（nCas9 与 Moloney 鼠白血病病毒 RT（M-MLV RT）的融合）1 – 3 > 6.3 千碱基 (kb)，超出了 AAV 的包装能力。高产量生产如此大的蛋白质或 mRNA（用于核糖核蛋白 (RNP) 或 RNA 递送）也是一项挑战。尽管一些拆分策略已用于递送 Cas9 相关基因组编辑工具 4 ，包括拆分内含肽 5 – 7 和 MS2（参考文献 8 – 10）或 SunTag 11 系链，但大多数拆分方法才刚刚开始应用于 PE 2、12、13。这些元素增加了 PE 系统的尺寸、分子复杂性以及生产和递送负担，并且限制了 PE 开发的组合吞吐量（即核酸酶和 RT 成分的混合和匹配）。pegRNA 优化对于有效的引物编辑也很重要。当前的 pegRNA 是一种结合 RNA，由 sgRNA 和包含 RT 模板 (RTT) 和引物结合位点 (PBS) 的 3′ 延伸组成。尽管在 PE 系统中整合 RNA 分子很简单，但由于 PBS 和间隔区之间不可避免的碱基配对以及潜在的 RTT-支架相互作用，它容易发生 RNA 错误折叠。最后，pegRNA 中的 3′ 末端延伸暴露在外，易受核酸酶降解，这可能会损害 pegRNA 的完整性。虽然 3′ 末端二级结构提高了 pegRNA 的稳定性 14 ，但仍需要进一步努力减少 pegRNA 的错误折叠和不稳定性。
QuantPrime-一种用于定量PCR的可靠高通量引物设计的灵活工具，
结果：在这里，我们介绍了QuantPrime，这是一种直观且用户友好的全自动工具，用于小型至大规模的QPCR分析中的引物对设计。QuantPrime可以通过Internet http://www.quantprime.de/在线使用，也可以在下载后在本地计算机上使用；它提供具有高度可自定义参数的设计和特异性检查，并准备与许多重要的高等真核模型生物和植物作物的公开转录组一起使用（目前总共有295种），同时受益于外显子边框和可用基因组注释中的替代剪接变体信息。模型植物拟南芥，作物Hordeum vulgare和模型绿色Alga Chlamydomonas Reinhardtii的实验结果显示，设计的底漆对的成功率超过96％。
1 LeishGEdit 工具箱的 Bar-seq 策略 2
LeishGEdit 引物设计流程为基因组中每个给定的 ORF 设计了总共六个引物序列，以实现 CRISPR-Cas9 基因编辑，从而允许用大量可用标签标记感兴趣基因的 N 端或 C 端，并删除 ORF 的两个等位基因（图 1B 和 C）。设计了两个 sgRNA 引物，一个靶向目标基因的 5'UTR，一个靶向 3'UTR。sgRNA 引物由 T7 RNAP 启动子序列、20 nt sgRNA 靶序列（用于在感兴趣的位点引入 DSB）和 20 nt 与 CRISPR-Cas9 主链序列的重叠组成，从而允许通过 PCR 生成 sgRNA 模板。需要一个包含整个 sgRNA 主链序列 [20] 的额外通用引物来扩增两个 sgRNA。四种引物专为 pPLOT 和 pT 质粒扩增而设计，可以以不同的组合使用 82 来产生供体 DNA。这些引物包括：上游正向引物 (#1)、83 上游反向引物 (#2)、下游正向引物 (#3) 和下游反向引物 (#4)。可以选择性地设计 84 额外引物，以允许使用从 pPOT 质粒模板扩增的供体 85 构建体进行 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑 [21]。供体 DNA 引物包含紧邻 sgRNA 靶序列及其 PAM 位点的 30 nt HF 序列 86，以及与 pT、pPLOT 和 pPOT 质粒兼容的引物结合位点 87。虽然上游正向引物和下游 88 反向引物位置始终根据所选的 sgRNA 而变化，但上游反向引物 89 (#2) 和下游正向引物 (#4) 针对每个基因设计在相同的位置。90