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加强有机执法（SOE）最终规则引物
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一个具有零排放的新过程，用于真正的生物降解...评估环境DNA的五个引物对...
作者格式，未经同行评审的文档发布于2023年3月31日。doi：https：//doi.org/10.3897/arphapreprints.e104185
使用 PlantPegDesigner 和工程植物引物编辑器 (ePPE) 优化单子叶植物的引物编辑
引物编辑器 (PE) 可以在不造成供体 DNA 或双链断裂的情况下安装所需的碱基编辑，已用于植物，原则上可以加速作物改良和育种。然而，它们在植物中的编辑效率通常较低。通过基于熔化温度设计序列来优化引物编辑向导 RNA (pegRNA)、使用双 pegRNA 和工程 PE 均已被证明可以提高 PE 效率。此外，基于水稻引物编辑实验数据开发了一个自动化 pegRNA 设计平台 PlantPegDesigner。在本方案中，我们介绍了使用 PlantPegDesigner 设计和优化 pegRNA、构建具有增强编辑效率的工程植物 PE 载体进行引物编辑、使用报告系统评估引物编辑效率以及通过深度扩增子测序比较 PE 的有效性和副产物的详细方案。利用该方案，研究人员可以在4 – 7天内构建优化的用于引物编辑的pegRNA，并在3个月内获得引物编辑的水稻或小麦植物。
从 CRISPR/gRNA 引物的设计到验证......
收到日期：2022 年 4 月 14 日；修订日期：2022 年 5 月 31 日；接受日期：2022 年 5 月 31 日，出版日期：2022 年 5 月 31 日 DOI：10.6026/97320630018471 出版伦理声明：作者声明他们遵守 COPE 出版伦理指南，如 https://publicationethics.org/ 其他地方所述。作者还承诺，他们与任何其他第三方（政府或非政府机构）无关联，且与本出版物有任何形式的不道德问题有关。作者还声明，他们没有隐瞒有关本文的任何误导出版商的信息。 官方电子邮件声明：通讯作者声明，并非所有作者都可以获得其机构的终身官方电子邮件 许可声明：这是一篇开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、分发和复制，前提是对原始作品进行适当的归功于。本文章根据 Creative Commons 署名许可条款发布。读者评论：BIOINFORMATION 上发表的文章开放供相关发表后评论和批评，这些评论和批评将立即发布，并附有原始文章的链接，无需支付开放获取费用。评论应简洁、连贯且具有批判性，字数不得超过 1000 字。
具有不受束缚的逆转录酶和环状 RNA 模板的分裂引物编辑器
Es 可实现删除、插入和碱基替换而不会造成双链断裂 1 。然而，目前的 PE2、PE2* 和 PEmax 效应物（nCas9 与 Moloney 鼠白血病病毒 RT（M-MLV RT）的融合）1 – 3 > 6.3 千碱基 (kb)，超出了 AAV 的包装能力。高产量生产如此大的蛋白质或 mRNA（用于核糖核蛋白 (RNP) 或 RNA 递送）也是一项挑战。尽管一些拆分策略已用于递送 Cas9 相关基因组编辑工具 4 ，包括拆分内含肽 5 – 7 和 MS2（参考文献 8 – 10）或 SunTag 11 系链，但大多数拆分方法才刚刚开始应用于 PE 2、12、13。这些元素增加了 PE 系统的尺寸、分子复杂性以及生产和递送负担，并且限制了 PE 开发的组合吞吐量（即核酸酶和 RT 成分的混合和匹配）。pegRNA 优化对于有效的引物编辑也很重要。当前的 pegRNA 是一种结合 RNA，由 sgRNA 和包含 RT 模板 (RTT) 和引物结合位点 (PBS) 的 3′ 延伸组成。尽管在 PE 系统中整合 RNA 分子很简单，但由于 PBS 和间隔区之间不可避免的碱基配对以及潜在的 RTT-支架相互作用，它容易发生 RNA 错误折叠。最后，pegRNA 中的 3′ 末端延伸暴露在外，易受核酸酶降解，这可能会损害 pegRNA 的完整性。虽然 3′ 末端二级结构提高了 pegRNA 的稳定性 14 ，但仍需要进一步努力减少 pegRNA 的错误折叠和不稳定性。
一种新的方法，用于与SARS-COV-2 PCR引物设计的前瞻性突变预测进行保守序列提取
虽然已经揭示了SARS-COV-2的整个基因组序列，但还证明SARS-COV-2的基因组与SARS-COV和MERS-COV的基因组具有分别为80％和50％的基因组。鉴于SARS-COV-2感染和死亡率数据，COVID-19的诊断和治疗在世界各地突出。 由于生物技术科学家已经开发了许多RT-PCR套件。 但是，病毒是快速突变的生物，为了提高准确性，长期可行性并避免RT-PCR分析的关闭目标结果，病毒基因组的区域，具有低突变率的病毒基因组和针对这些区域的引物的设计非常重要。 在此范围内，我们提出了一种新型算法，该算法可用于查找SARS-COV-2的低突变率区域和根据这项研究中算法的发现设计的引物。鉴于SARS-COV-2感染和死亡率数据，COVID-19的诊断和治疗在世界各地突出。由于生物技术科学家已经开发了许多RT-PCR套件。但是，病毒是快速突变的生物，为了提高准确性，长期可行性并避免RT-PCR分析的关闭目标结果，病毒基因组的区域，具有低突变率的病毒基因组和针对这些区域的引物的设计非常重要。在此范围内，我们提出了一种新型算法，该算法可用于查找SARS-COV-2的低突变率区域和根据这项研究中算法的发现设计的引物。
用于 AAV 递送的拆分金黄色葡萄球菌引物编辑器
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2021 年 1 月 11 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.01.11.426237 doi：bioRxiv preprint
植物引物编辑器实现水稻细胞的精准基因编辑
基因组编辑正在彻底改变植物研究和作物育种。序列特异性核酸酶 (SSN)，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和 TAL 效应核酸酶 (TALEN)，已用于产生位点特异性 DNA 双链断裂并通过促进同源定向修复 (HDR) 实现精确的 DNA 修饰 (Steinert 等人，2016 年；Voytas，2013 年)。后来，RNA 引导的 SSN，例如 CRISPR-Cas9、Cas12a、Cas12b 及其变体，已应用于植物基因组编辑 (Li 等人，2013 年；Nekrasov 等人，2013 年；Tang 等人，2017 年；Zhong 等人，2019 年；Ming 等人，2020 年；Tang 等人，2019 年)。然而，HDR 依赖于 SSN 和 DNA 供体的同时递送，这在植物中一直具有挑战性（ Steinert 等，2016； Zhang 等，2019）。在植物中实现高效 HDR 的另一个挑战是，在大多数细胞类型中，DNA 修复倾向于非同源末端连接（NHEJ）途径而不是 HDR（ Puchta，2005； Qi 等，2013）。与受供体选择和 DNA 修复机制限制的 SSN 诱导的 HDR 不同，近年来开发的胞苷或腺嘌呤碱基编辑器可以在原型间隔物中 3-8 个核苷酸靶向窗口内将 C 转换为 T 或将 A 转换为 G（ Komor 等，2016； Nishida 等，2016； Gaudelli 等，2017）。碱基编辑器虽然效率很高，但只能指导某些转换突变，而不能执行预定的颠换突变或插入和缺失 (indel)。在所有这些背景下，最近在人类细胞中开发所谓的引物编辑器 (PE) 方面取得的突破非常令人兴奋 ( Anzalone 等人，2019 )。在引物编辑中，Cas9H840A 切口酶与逆转录酶融合。融合蛋白在编辑 DNA 链上切口，通过引导到切口 DNA 并复制由引物编辑向导 RNA (pegRNA) 编码的遗传信息来启动逆转录。多功能的 pegRNA 是一种经过修饰的单向导 RNA (sgRNA)，其 3' 端携带逆转录 (RT) 模板和引物结合位点 (PBS) 或序列中的引物。与 HDR 不同，PE 不需要 DNA 供体。在某些目标位点，PE 似乎也比碱基编辑器更精确、更高效（Anzalone 等人，2019 年）。
一种改善 siRNA 和 mRNA 系统输送的纳米引物
摘要：尽管人们对基因疗法有着极大的兴趣，但核酸的系统递送仍然面临巨大的挑战。要成功施用核酸，一种方法是将它们封装在脂质纳米颗粒 (LNP) 中。然而，静脉内施用的 LNP 大量积聚在肝脏中，并被网状内皮系统 (RES) 吸收。在这里，我们在 LNP 之前施用一种旨在暂时占据肝细胞的脂质体，即纳米引物。这项研究表明，用纳米引物预处理小鼠会降低 RES 对 LNP 的吸收。通过在肝细胞中快速积累，纳米引物提高了包裹人促红细胞生成素 (hEPO) mRNA 或因子 VII (FVII) siRNA 的 LNP 的生物利用度，分别导致更多的 hEPO 产生（增加 32%）或 FVII 沉默（增加 49%）。纳米引物的使用为改善 RNA 疗法的系统输送提供了一种新策略。关键词：mRNA、siRNA、脂质纳米颗粒、纳米载体、核酸疗法、纳米引物、Kup 细胞