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第 18 章 RAS 致癌基因的故事
第 18 章 RAS 致癌基因的故事 221007bu3 抗癌药物：发现和寻求治愈方法的故事 Kurt W. Kohn，医学博士，哲学博士 名誉科学家 分子药理学实验室 发育治疗学分部 美国国立癌症研究所 马里兰州贝塞斯达 kohnk@nih.gov 第 18 章 RAS 致癌基因的故事 病毒中的 RAS 致癌基因。RAS 基因是人类癌症中一个特别重要的基因或致癌基因家族，它首次是在对致癌病毒的研究中发现的。1963 年的某个时候，在伦敦医院研究实验室癌症研究部工作的 Jennifer Harvey 给小鼠和大鼠接种了一只患有病毒诱发的白血病的大鼠的血浆。她定期将病毒从一只动物转移到另一只动物，从而诱发它们患上白血病。然而，那一年的一次，她注意到一些不寻常的东西，这为癌症的成因和治疗打开了一扇新的窗户（Harvey，1964 年）。接种了她一只白血病大鼠病毒的小鼠，除了常见的白血病（血液和淋巴结中有恶性细胞，而不是各种组织中的肿块）外，还意外地患上了实体瘤。后来发现，她的白血病病毒从大鼠自己的基因组中获取了一段 DNA 片段（拼接到其基因组中）。这段 DNA 现在是新病毒基因组的一部分，导致她的小鼠出现实体瘤型癌症肿块。此外，新的癌症基因被发现是正常基因 RAS 的突变版本（可能是大鼠肉瘤，突变版本最早是在大鼠肉瘤中发现的）。Harvey 的名字因新发现的 HRAS 致癌基因中的字母 H 而永垂不朽，HRAS 致癌基因是正常 HRAS 基因的突变形式。哈维的新病毒导致培养皿表面的细胞过度生长，形成“病灶”（图 18.1），其方式与温伯格团队后来在致癌基因研究中观察到的情况类似（第 15 章中的图 15.3）。电子显微镜图像中看到的哈维病毒颗粒具有非常不寻常的结构，类似于辐条轮（图 18.2）。
鉴定针对黄素病毒和冠状病毒的蛋白酶抑制剂
载体传播的黄病毒和人畜共患病的冠状病毒是重要的人类病原体，对全球公共卫生构成了严重威胁。黄病毒，在那里它们被节肢动物载体传播，每年引起数百万个感染。虽然大多数感染是轻度或无症状的，但登革热和黄热病病毒（如黄热病病毒）可能会引起潜在的致命性出血热和休克综合征。神经性黄病毒，例如西尼罗河，日本脑炎和tick虫脑炎（TBEV）会导致具有长期症状的脑膜脑炎。冠状病毒，尤其是SARS（2003）和MERS（2012）（2012年）（2012年）的人畜共患病毒，如2000年代初期一直在定期出现。最新的例子是SARS-COV-2，它在中国城市武汉引起了一系列感染后，遍布全世界，目前造成超过690万人死亡。尽管在SARS-COV-2的情况下，疫苗对于预防感染或严重疾病和住院是至关重要的，但抗病毒药是一种非常有价值的工具，可用于治疗和预防当前和未来的黄病毒和冠状病毒感染。在本文中提出的工作中，我们使用了硅和体外技术的组合来识别和测试病毒蛋白酶潜在抑制剂的活性。在我们的第一项研究（论文1）中，我们意外地鉴定出具有对ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的体外活性的HIV蛋白酶抑制剂。Covid-19爆发后，我们将注意力转移到SARS-COV-2上。通过虚拟筛选已知蛋白酶抑制剂的库来鉴定抑制剂，该抑制剂通过分子动力学模拟评估，并最终使用基于FRET的酶促测定法对重组ZIKV蛋白酶进行了测试。还使用了分子对接和分子动力学模拟的相同组合来正确预测已知的泛氟韦蛋白酶抑制剂对TBEV蛋白酶的活性（论文2）。结果，我们是第一个报告基于肽的化合物，具有对TBEV的体外活性。我们首先测试了广谱抗病毒一氧化氮（NO）的抑制作用，并发现无释放的化合物快照对基于细胞的测定中的SARS-COV-2复制具有剂量依赖性抑制作用（论文3）。我们推测SNAP可以通过对SARS-COV-2主要蛋白酶的催化Cys145的反硝化来抑制SARS-COV-2蛋白酶，并发现SNAP对体外酶试验中的重组SARS-COV-2 MPRO蛋白酶具有剂量依赖性抑制作用。在我们的最后一项研究（论文4）中，我们通过对含有42亿种化合物的DNA编码的化学文库的亲和力筛选来确定一类新的有效SARS-COV-2蛋白酶抑制剂。所鉴定的化合物抑制了IC50低至25 nm的重组SARS-COV-2蛋白酶，并且在感染的CALU-3和CACO-2细胞系中低微摩尔范围内的剂量依赖性抗病毒作用。
患有 1 型糖尿病的男性职业运动员在运动、恢复和睡眠期间的血糖模式：整个赛季的回顾性观察研究
1. Colberg SR、Sigal RJ、Yardley JE 等人。体力活动/锻炼与糖尿病：美国糖尿病协会立场声明。糖尿病护理。2016；39(11):2065-2079。doi: 10.2337/dc16-1728 2. Chetty T、Shetty V、Fournier PA、Adolfsson P、Jones TW、Davis EA。针对患有 1 型糖尿病的年轻人的运动管理：一种结构化的运动咨询方法。前沿内分泌学。2019；10:326。doi: 10.3389/fendo.2019.00326 3. Chimen M、Kennedy A、Nirantharakumar K、Pang TT、Andrews R、Narendran P。体力活动对 1 型糖尿病患者有哪些健康益处？文献综述。 Diabetologia 。2012；55(3):542-551。doi: 10.1007/s00125-011-2403-2 4. Riddell MC、Gallen IW、Smart CE 等。1 型糖尿病的运动管理：共识声明。柳叶刀糖尿病内分泌学。2017；5(5):377-390。doi: 10.1016/s2213-8587(17)30014-1 5. Lascar N、Kennedy A、Hancock B 等。1 型糖尿病（T1DM）成人患者对运动的态度和障碍以及如何最好地解决它们：一项定性研究。PLoS One 。2014；9(9):e108019。 doi: 10. 1371/journal.pone.0108019 6. Brazeau AS、Rabasa-Lhoret R、Strychar I、Mircescu H。1 型糖尿病患者进行身体活动的障碍。糖尿病护理。2008；31(11)：2108-2109。doi: 10.2337/dc08-0720 7. Scott SN、Christiansen MP、Fontana FY 等。评估 7 天分段赛中患有 1 型糖尿病的职业自行车运动员血糖管理相关因素。糖尿病护理。 2020;43(5):1142-1145。doi: 10.2337/dc19-2302 8. Gawrecki A、Zozulinska-Ziolkiewicz D、Matejko B、Hohendorff J、Malecki MT、Klupa T。四名患有 1 型糖尿病的男性安全完成越野跑超级马拉松。糖尿病技术治疗。2018；20(2): 147-152。doi: 10.1089/dia.2017.0296 9. Hill NE、Campbell C、Buchanan P、Knight M、Godsland IF、Oliver NS。1 型糖尿病患者在耐力运动过程中的生化、生理和心理变化。糖尿病科学技术杂志。2017；11(3):529-536。 doi: 10.1177/1932296816671956 10. Moser O、Dietrich M、McCarthy O、Bracken RM、Eckstein ML。对于患有 1 型糖尿病的运动员，在 5 天的专业公路自行车比赛中，胰岛素推注剂量取决于前一天的比赛强度：一项前瞻性观察研究。糖尿病、肥胖、代谢。2020；22(10)：1714-1721。doi: 10.1111/dom.14083 11. Lespagnol E、Bocock O、Heyman J 等人。对于患有 1 型糖尿病的业余运动员，9 天的中等至高强度骑行意外地增加了高血糖时间，这与心率变异性受损有关。糖尿病护理。 2020；43(10):2564-2573。 DOI：10.2337/dc19-1928
什么是DNA隔离定义
DNA提取自1869年弗里德里希·米舍（Friedrich Miescher）首次试图隔离它以来，它已经走了很长一段路，意外地发明了一种核酸隔离方法，后来其他人会完善。该过程涉及分解细胞膜和核信封以获得DNA，这对于PCR，DNA克隆，测序和电泳等各种分子生物学应用至关重要。取决于样本类型 - 需要植物，血液，细菌或其他 - 需要不同的提取方法，每种方法都有自己的手术，以确保DNA的所需纯度和数量。从苯酚 - 氯仿等醇到蛋白酶K，CTAB，自旋柱，磁珠等等，存在各种技术，每个技术都基于样品的特定要求选择。DNA提取的故事是连续的创新和精致之一，像Meselson和Stahl这样的先驱在1958年建立了全功能程序，而其他人则随着时间的推移贡献了他们的方法。从细胞中提取DNA的过程涉及三个主要步骤：细胞裂解，沉淀和溶解DNA。所使用的化学或组合的类型可能会根据目标和细胞类型而有所不同。对于柔软的细胞壁，如在结核分枝杆菌中发现的，用简单的裂解缓冲液加热是有效的。然而，较硬的细胞壁需要机械，化学和酶促方法来提取DNA。基于化学的DNA提取方法是基于溶液的，涉及各种有机和无机溶液。这些包括SDS，CTAB，苯酚，氯仿和硫氰酸鸟酯。所有程序的主要步骤是细胞裂解，降水和洗脱。基于溶液的（化学）DNA提取进一步分为基于有机溶剂的和基于无机溶剂的方法。有机溶剂（如苯酚和氯仿）以前已被使用，但由于危险而灰心。相反，采用了更安全的替代方案，例如Triton X100和EDTA。不同的化学物质有特定目的；蛋白酶K等酶分解蛋白质直接靶向氨基酸连接。DNA提取过程的有效性可能受细胞类型的影响以及某些化合物或化学物质组合的使用。在冷链中，尽管有一些缺点，但基于蛋白酶K的DNA分离方法还是有效的方法。此过程的一个问题是酶的稳定性降低，随着时间的流逝而降低。使用无机溶液（例如氯化钠和乙酸钾）与蛋白酶K结合使用的盐溶液。但是，提取的DNA的纯度可能是一个问题，因为尽管获得了足够的质量，但收益率可能不会令人满意。苯酚 - 氯仿 - 异氧化酒精法（PCI）是提取DNA的另一种流行技术。它使用液化缓冲液，苯酚和氯仿对蛋白质和破坏细胞，从而产生出色的产率和纯度。可以通过使用现成的DNA提取缓冲区来修改此方法，从而快速而简单。高质量的DNA产量和简单操作系统对于准确的DNA分析至关重要。相反，基于二氧化硅的DNA提取方法提供了一种独特的方法，依赖于二氧化硅和DNA相互作用的独特化学。带正电荷的二氧化硅颗粒在离心过程中与带负电荷的DNA结合，从而允许高质量的DNA产量和易于操作。由于其简单性和有效性，该市售技术已在诊断实验室中被广泛接受。为了验证提取的DNA，可以使用溴化乙锭或其他与DNA在UV光下反应的荧光染料在琼脂糖凝胶上电泳。通过计算260 nm和280 nm波长的吸光度来测量DNA的纯度。确定DNA纯度的最常见方法是A260/A280比率，对于优质DNA，应在1.7-2.0之间。较低的比率表明存在更多的污染物。荧光测量是确定DNA产量和浓度的另一种流行方法，它由于其广泛的可用性和比吸光度方法更高的灵敏度。也可以使用二苯胺（DPA）指示器确认DNA的存在，该指标涉及DNA化学水解。与分光光度计在600 nm处的吸光度强度也可以通过将DNA浓度与已知DNA浓度的标准曲线进行比较来确定DNA浓度。已开发和应用多种用于DNA提取的方法，包括用于传染病的护理核酸测试和人类DNA提取方法。方法的选择取决于DNA的特定应用和所需的质量。