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World File Search System拟南芥
两个同源吲哚-3-乙酰胺 (IAM) 水解酶基因是拟南芥中 IAM 的生长素效应所必需的
吲哚-3-乙酰胺 (IAM) 是某些植物病原菌中第一个被证实的生长素生物合成中间体。外源施用 IAM 或通过过表达拟南芥中的细菌 iaaM 基因产生 IAM 会导致生长素过量产生表型。然而，植物是否使用 IAM 作为生长素生物合成的关键前体仍不确定。在此，我们报告了从正向遗传筛选中分离拟南芥中的 IAM 水解酶 1 (IAMH1) 基因，该筛选用于显示正常生长素敏感性的 IAM 不敏感突变体。IAMH1 有一个相近的同源物，名为 IAMH2，位于拟南芥 IV 染色体上 IAMH1 的旁边。我们使用我们的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术生成了 iamh1 iamh2 双突变体。我们发现，IAMH 基因的破坏使拟南芥植物对 IAM 处理产生抗性，同时也抑制了 iaaM 过表达表型，这表明 IAMH1 和 IAMH2 是拟南芥中将 IAM 转化为 IAA 的主要酶。iamh 双突变体没有表现出明显的发育缺陷，这表明 IAM 在正常生长条件下在生长素生物合成中不起主要作用。我们的研究结果为阐明 IAM 在生长素生物合成和植物发育中的作用奠定了坚实的基础。
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水稻种子休眠4同源物RDO5 1的逆转与bHLH57相互作用控制拟南芥脱落酸的生物合成和种子休眠[打开]
脱落酸 (ABA) 对种子休眠的控制已得到广泛研究，但其潜在机制尚未完全了解。本文，我们报告了拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中两种与 ABA 相关的种子休眠调节剂的特征：ODR1（用于逆转 rdo5），水稻 (Oryza sativa) 种子休眠 4 (Sdr4) 的直系同源物，以及碱性螺旋-环-螺旋转录因子 bHLH57。ODR1 的转录水平直接受到转录因子 ABA INSENSITIVE3 (ABI3) 的抑制，它通过影响 ABA 生物合成和 ABA 信号传导来负向调节种子休眠。相比之下，bHLH57 通过诱导基因 9-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE6 ( NCED6 ) 和 NCED9 的表达来正向调节种子休眠，这两个基因编码 ABA 生物合成酶，从而导致更高的 ABA 水平。ODR1 与 bHLH57 相互作用并抑制 bHLH57 调节的 NCED6 和 NCED9 在细胞核中的表达。bhlh57 功能丧失等位基因可以部分抵消 odr1 突变体中增强的 NCED6 和 NCED9 表达，因此可以挽救它们相关的超休眠表型。因此，我们确定了一个新颖的 ABI3-ODR1-bHLH57-NCED6/9 网络，该网络为了解 ABA 生物合成和信号传导对种子休眠的调节提供了见解。
CRISPR–Cas9 介导的拟南芥可遗传染色体易位的诱导
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) - CRISPR 相关蛋白 (Cas) 技术已应用于植物育种，主要用于改良单个或多个性状的基因 1 – 4 。本文我们表明，这项技术还可用于重组植物染色体。利用来自金黄色葡萄球菌 5 的 Cas9 核酸酶，我们能够在拟南芥中诱导异源染色体之间 Mbp 范围内的相互易位。值得注意的是，在没有经典的非同源末端连接途径的情况下，易位频率大约高出五倍。利用 Cas9 核酸酶的卵细胞特异性表达和连续的批量筛选，我们能够分离可遗传事件并建立易位纯合的品系，单个品系的频率高达 2.5%。通过分子和细胞学分析，我们证实了在拟南芥 1 号和 2 号染色体之间以及 1 号和 5 号染色体之间获得的染色体臂交换是保守的和相互的。诱导染色体易位可以有针对性地模拟基因组进化或染色体修改，固定或打破不同染色体上性状之间的遗传连锁。植物基因组的受控重组有可能改变植物育种。鉴于养活快速增长的人口的挑战以及气候变化对农业的影响，对新作物品种的需求日益增加。随着传统育种已达到极限，使用基因组编辑工具对作物进行理想性状改造正成为主要关注点 6 。应用 CRISPR-Cas 系统定向诱导位点特异性双链断裂 (DSB) 使得基因编辑既可用于植物基础研究，也可用于农业性状的产生和改良 7 。在包括植物在内的多细胞真核生物中，DSB 的修复主要由两种途径介导，非同源末端连接 (NHEJ) 和同源重组 8 。通过易错的 NHEJ 进行的修复通常与断裂位点处的序列信息丢失有关，而同源重组主要导致无错修复 9 。在植物中，NHEJ 是体细胞组织中普遍的修复途径。NHEJ 可进一步细分为经典 NHEJ (cNHEJ) 和替代 NHEJ (aNHEJ) 途径 10 。在 cNHEJ 的情况下，断端直接重新连接，有时会导致断裂位点处的小插入或缺失 (indel)。aNHEJ 利用靠近断裂位点的微同源性并依赖于聚合酶 theta，导致与插入部分相关的微同源性之间的序列信息缺失 11,12 。一次诱导多个 DSB 可以通过 NHEJ 将不相关的断裂末端连接起来，从而导致基因组中复杂的重排。
一种用于拟南芥基因组中 T-DNA 插入片段高通量定位的接头连接介导 PCR 方法
农杆菌转移 DNA (T-DNA) 是一种有效的植物诱变剂，已用于在拟南芥中创建序列索引的 T-DNA 插入系，作为研究基因功能的工具。创建 T-DNA 插入系需要一种可靠的方法来定位基因组中的插入位点。在本方案中，我们描述了一种接头连接介导的 PCR 方法，我们已使用该方法筛选突变体文库并识别了超过 150,000 个 T-DNA 插入突变体；该方法还可用于绘制单个突变体的图谱。该过程包括三个步骤：限制性酶介导的接头与基因组 DNA 的连接；使用针对接头和 T-DNA 的特异性引物对 T-DNA/基因组 DNA 连接处进行 PCR 扩增；对 T-DNA/基因组连接处进行测序以便绘制到参考基因组。在大多数情况下，测序的基因组区域延伸到 T-DNA 边界，从而可以识别插入物的准确位置。整个过程需要2周时间才能完成。