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World File Search System敲低
人类 T 细胞的大规模并行敲入工程
靶向基因敲入在细胞治疗中的应用效率普遍较低，规模有限。本研究开发了CLASH系统，该系统能够实现高效、高通量的基因敲入工程。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与混合腺相关病毒结合，通过大规模并行同源定向修复介导同时基因编辑和精准转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体池，每个变体都具有靶向基因编辑功能。我们将该技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了时间进程式CLASH实验，从而实现了有利的CAR-T变体的混合生成和无偏选择。 CLASH 实验中出现了一种独特的 CRISPR RNA (crRNA)，它可以在 CAR-T 中生成 PRDM1 的外显子 3 跳跃突变，从而增强这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命，从而在多种癌症模型（包括实体瘤模型）中提高体内疗效。CLASH 的多功能性使其广泛应用于各种细胞和治疗工程应用。
基于CRISPR的靶向转基因敲入和基因校正的策略
引言定期插入了短期短篇小学重复序列（CRISPR）已彻底改变了转基因研究和人类基因疗法的领域1 - 6。使用CRISPR，可以将与人类疾病相关的特定遗传变异引入基因组中，也可以通过设计分别由细胞和生物体的设计中的野生型等位基因代替基因组中的突变，以进行基因敲入或基因校正7-12。然后可以研究CRISPR修饰的细胞和动物模型，以发现人类疾病和药物发现的基础机制13 - 15。因此，CRISPR具有巨大的翻译潜力。CRISPR技术已被探索用于体内基因疗法，以治疗各种人类遗传疾病16-18以及过体基因疗法以治疗血液疾病，可以通过将患者的细胞在其身体外的基因改造19-23。最近几年，提高了性能和超长的巨大进步，而疾病模型和基因疗法的CRISPR介导的基因插入和替代的潜力。
胰腺癌中 ANGPTL4 过表达的转录组学和功能分析提名逆转化学耐药性的靶点
ANGPTL4 有助于患者生存，特别是它如何通过可能在耐药性中发挥作用来改变生存结果。我们使用 CRISPRa (MP2_ANGPTL4_OE) [21] 和 siRNA 敲低 (MP2_ANGPTL4_KD) 测量了 ANGPTL4 在 MIA PaCa-2 细胞系中过表达和敲低的影响。qPCR 显示，与非靶向对照向导相比，CRISPRa 成功地将 ANGPTL4 转录物的表达提高了 8 倍。同样，siRNA 敲低使对照系的表达降低了 90% 以上（图 1B，补充表 S1）。蛋白质水平受到类似影响（补充图 S1B）。我们使用 RNA 测序测量了修饰细胞系和对照的全局基因表达变化，结果显示 1198 个差异表达基因 (DEG) 符合以下标准：它们的平均读取数大于 10，绝对 log 2 倍变化 (log2FC) 至少
胶质母细胞瘤患者放射治疗的个性化问题的生物学方面
谷氨酰胺是胶质母细胞瘤细胞的必要底物，对肿瘤生长很重要。我们研究了ERN1敲低对EGFR，ERBB2，TOB1和CEBPB基因表达在U87MG胶质母细胞瘤细胞中响应谷氨酰胺缺乏的影响。表明，EGFR和ERBB2基因的表达水平与对照胶质母细胞瘤细胞中的谷氨酰胺缺乏症相关，但ERN1敲低导致上调这些基因表达。此外，在对照和ERN1敲低胶质母细胞瘤细胞中，TOB1和CEBPB基因表达对谷氨酰胺剥夺敏感，但抑制ERN1会显着提高这些基因对谷氨酰胺剥夺的敏感性，尤其是CEBPB基因。这些结果表明，内质网应激的主要信号通路ERN1控制着所有研究的基因对基因特异性方式胶质母细胞瘤细胞中谷氨酰胺剥夺的敏感性，并且以基因特异性方式，并且较低路径。
NEAT1–SOD2 轴通过激活肝癌细胞系中的 AKT 赋予索拉非尼和仑伐替尼耐药性
摘要：本研究探讨了长链非编码 RNA 核副斑马组装转录本 1 (NEAT1) 变体 1 (NEAT1v1) 对肝癌细胞系耐药性的影响。NEAT1 敲低激活了丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号通路，包括 MAPK 激酶 (MEK)/细胞外信号调节激酶 (ERK)，但抑制了 AKT。此外，NEAT1 敲低使肝癌细胞对索拉非尼和仑伐替尼敏感，这两种药物均在临床上用于治疗肝细胞癌，而它却使肝癌细胞对 AKT 靶向药物 capivasertib 产生耐药性。NEAT1v1 过表达抑制了 MEK/ERK 并激活了 AKT，导致对索拉非尼和仑伐替尼产生耐药性并对 capivasertib 产生敏感。超氧化物歧化酶 2 (SOD2) 敲低可逆转 NEAT1v1 过表达对分子靶向药物敏感性的影响。尽管 NEAT1 或 SOD2 敲低增强了内质网 (ER) 应激，同时抑制了 AKT，但 ER 应激抑制剂牛磺脱氧胆酸并未恢复 AKT 活性。虽然还需要进一步的体内和临床研究，但这些结果表明 NEAT1v1 通过 SOD2 将肝癌细胞系的生长模式从 MEK/ERK 依赖模式转变为 AKT 依赖模式，并独立于 ER 应激调节对分子靶向药物的敏感性。
通过 Cas13d- 调节代谢功能...
体内 RNA 敲低在疾病建模和治疗方面具有巨大潜力。尽管 CRISPR/Cas9 介导的永久性敲除靶基因的方法层出不穷，但针对 RNA 进行破坏的策略在治疗获得性代谢疾病（当不适合永久性修改基因组 DNA 时）和 RNA 病毒感染疾病（当没有致病 DNA 时，例如 SARS-Cov-2 和 MERS 感染）方面具有优势。最近，RNA 靶向 CRISPR 效应物 Cas13d 家族已被证明能够在体外实现对哺乳动物细胞中细胞 RNA 的强效下调（Konermann 等人，2018 年）。在各种 Cas13d 亚型中，CasRx（RfxCas13d）在 HEK293T 细胞中表现出最强的 RNA 敲低效率（Konermann 等人，2018 年）。然而，Cas13d 的 RNA 靶向活性仍需在体内进行验证。在本研究中，CasRx 系统被证明可以在小鼠肝细胞中有效且功能性地敲低与代谢功能相关的基因，包括 Pten 、 Pc- sk9 和 lncLstr 。CasRx 介导的多个基因同时敲低也可以通过 sgRNA 阵列实现，这为调节复杂的代谢网络提供了一种有用的策略。此外，AAV（腺相关病毒）介导的 CasRx 和 Pcsk9 sgRNA 递送到小鼠肝脏中成功降低了血清 PCSK9，从而显着降低血清胆固醇水平。重要的是，CasRx 介导的 Pcsk9 敲低是可逆的，并且 Pcsk9 可以反复下调，这为可逆地调节代谢基因提供了一种有效的策略。本研究提供了一个成功的概念验证试验，表明有效和调控性地敲低目标代谢基因，以实现肝脏中的设计代谢调节。代谢调节基因的靶向抑制通常用于建模和开发代谢疾病的治疗方法（Moller，2012 年）。近年来，使用各种调节剂实现了许多代谢调节策略，包括许多小分子化合物、核酸和治疗性多肽/蛋白质，靶向单个或多个特定分子产物，如酶、循环蛋白、细胞表面受体和细胞 RNA（Moller，2012 年）。代谢调控的应用
敲低胎盘主要的促进剂超家族域，含有2A的孕妇小鼠降低了胎儿脑的生长和磷脂docosahexaenoic Acid
摘要：简介：Docosahexaenoic Acid（DHA）是n -3长链多不饱和脂肪酸，对于胎儿发育至关重要，胎盘通过胎盘从母亲传输到胎儿。含有2A（MFSD2A）的主要促进剂超级家族型溶血磷脂酰胆碱（LPC）转运蛋白位于人胎盘的合成型胞植物细胞的基础质膜中，人胎盘的胎盘膜细胞和MFSD2A表达与人类表达的人类表达与昏迷的corn lumbilical Corncly lppc-lpc-lpc-dha相关。我们假设孕妇小鼠中MFSD2A的胎盘特异性敲低会减少胎儿脑中的磷脂DHA的积累。方法：用表达EGFP的慢病毒（E3.5）的小鼠胚泡（E3.5），该慢病毒含有靶向MFSD2A或非编码序列（SCR）的shRNA，然后转移到假孕妇中。在E18.5时，称重胎儿，并收集其胎盘，大脑，肝脏和血浆。MFSD2A mRNA表达通过QPCR在大脑，肝脏和胎盘中测定，以及通过LC-MS/MS量化磷脂DHA。结果：与SCR对照相比，在E18.5（n = 45，p <0.008）时，靶向MFSD2A的shRNA在E18.5（n = 45，p <0.008）时将胎盘mRNA MFSD2A的表达降低了38％。MFSD2a在胎儿脑和肝脏中的表达不变。胎儿脑体重减少了13％（p = 0.006）。体重，胎盘和肝脏重量不受影响。胎儿脑磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺DHA含量较低，胎盘特异性MFSD2A敲低的胎儿含量较低。这些数据提供了机械证据，表明胎盘MFSD2A介导LPC-DHA的母体 - 饮食转移，这对于大脑生长至关重要。结论：LPC-DHA转运蛋白MFSD2A表达表达的胎盘特异性减少导致胎儿脑体重降低，胎儿大脑中磷脂DHA含量降低。
研究恶性疟原虫蛋白质功能的系统
疟疾是由疟原虫感染引起的，仍然是全球关注的重大健康问题。几十年来，遗传难治性和有限的工具阻碍了我们研究恶性疟原虫（与最严重的疟疾病例相关的寄生虫）中必需蛋白质和途径的能力。然而，近年来，我们在基因操纵恶性疟原虫和有条件控制蛋白质表达/功能的能力方面取得了重大飞跃。恶性疟原虫中使用的条件敲低系统针对中心法则的所有 3 个组成部分，使研究人员能够有条件地控制基因表达、翻译和蛋白质功能。在这里，我们回顾了一些已调整或开发用于恶性疟原虫的常见敲低系统。使用条件敲低方法所做的大部分工作是在无性生殖的血液阶段寄生虫中进行的，但我们也会重点介绍它们在生命周期其他部分的用途，并讨论在红细胞内阶段之外应用这些系统的新方法。随着这些工具的使用，该领域对寄生虫生物学的了解不断增加，并且正在发现抗疟药物开发的有希望的新途径。
MYC驱动的线粒体DNA拷贝数的增加发生了早期，并且在整个前列腺癌进展中持续存在
胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的脑癌，GBM干细胞（GSC）驱动治疗性耐药性和复发性。靶向GSC提供了预防肿瘤复发和改善预后的有希望的策略。我们识别SUV39H1，一种组蛋白-3，赖氨酸-9甲基转移酶，对于GSC维持和GBM进展至关重要。SUV39H1在GBM中被上调，单细胞RNA-Seq由于超增强剂介导的激活而在GSC中的表达主要显示。GSC中Suv39H1的敲低损害了它们的增殖和茎。 全细胞RNA-seq分析表明，SUV39H1调节G 2 /M细胞周期进展，干细胞维持和GSC中的细胞死亡途径。 通过将RNA-Seq数据与ATAC-SEQ数据集成在一起，我们进一步证明了SUV39H1的敲低改变了与这些途径相关的关键基因中的染色质可及性。 Chaetocin是SUV39H1抑制剂，模仿SUV39H1敲低的作用，将GSC的茎和敏化细胞降低到Temozolomide，这是标准GBM化学疗法。 在患者衍生的异种移植模型中，靶向SUV39H1抑制了GSC驱动的肿瘤生长。 在临床上，高SUV39H1表达与胶质瘤预后不良相关，支持其作为治疗靶点的相关性。 这项研究将SUV39H1确定为GSC维护的关键调节剂，并且是改善GBM治疗和患者结局的有前途的治疗靶标。GSC中Suv39H1的敲低损害了它们的增殖和茎。全细胞RNA-seq分析表明，SUV39H1调节G 2 /M细胞周期进展，干细胞维持和GSC中的细胞死亡途径。通过将RNA-Seq数据与ATAC-SEQ数据集成在一起，我们进一步证明了SUV39H1的敲低改变了与这些途径相关的关键基因中的染色质可及性。Chaetocin是SUV39H1抑制剂，模仿SUV39H1敲低的作用，将GSC的茎和敏化细胞降低到Temozolomide，这是标准GBM化学疗法。在患者衍生的异种移植模型中，靶向SUV39H1抑制了GSC驱动的肿瘤生长。在临床上，高SUV39H1表达与胶质瘤预后不良相关，支持其作为治疗靶点的相关性。这项研究将SUV39H1确定为GSC维护的关键调节剂，并且是改善GBM治疗和患者结局的有前途的治疗靶标。
区域间延迟在产生大...
结果：CS-SNRK - / - 小鼠对TAC的反应41表现出更差的心脏功能和心脏肥大，并且心脏中DDR Marker PH2AX的增加。此外，体外SNRK 42敲低导致DNA损伤和染色质压实增加，核平整度和3D体积的变化43。磷酸化 - 蛋白质研究确定了一个新型的SNRK靶标，44 DSTN，这是F-肌动蛋白去聚合因子（ADF）蛋白的成员，该蛋白直接与直接结合的F-actin结合，45 dypoletymerize F-肌动蛋白。SNRK与DSTN结合，除了细胞肥大外，DSTN下调还会逆转多余的DNA 46损伤和核参数的变化，而SNRK 47敲低。我们还证明，SNRK敲低促进了过度的肌动蛋白48解聚，该解聚，通过球状（G-）肌动蛋白与F-肌动蛋白的比率增加。最后，F-肌动蛋白的药理学稳定剂Jasplakinolide 49挽救了SNRK中DNA损伤增加和50个异常核形态的稳定剂。51