XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System无疤
无疤痕去除大型抗性岛可导致抗生素的敏感性和增加的鲍曼尼杆菌的自然转化性
摘要在基因组成方面具有巨大的多样性，包括多种推定的抗生素耐药性基因，阿巴岛是鲍曼尼杆菌杆菌多药的潜在贡献者。但是，ABAR对抗生素耐药性和细菌生理学的有效贡献仍然难以捉摸。为了解决这个问题，我们试图准确删除Abar Islands并恢复其插入站点的完整性。为此，我们设计了一种多功能无疤的基因组编辑策略。我们在最近的两个鲍曼尼菌临床菌株中形成了这种遗传修饰：分别携带19.7 kbp和86.2 kbp的Abar1和Abar1岛的菌株AB5075和菌株AYE。然后，在父母菌株及其固定衍生物之间进行抗生素敏感性。通过该岛的开放阅读框（ORF）的预测功能所预期的，抗抗性的抗抗药性在野生型和ABAR11固定的AB5075菌株之间相同。ABAR1具有25个ORF，预测抗生素类别具有抗性，并且AYE ABAR1固定衍生物显示出对多种类别的抗生素的可疑性。此外，ABARS的固化恢复了高水平的自然转化性。的确，大多数阿巴群岛都被插入与自然转化有关的通讯基因中。我们的数据表明，Abar插入有效地失活，并且还原的通信是功能性的。固化始终导致高度转换，因此很容易遗传诱因。ABAR的修改提供了对Abar获取功能的洞察力的见解。
有效的大规模和无疤痕基因组工程可以构建和筛选枯草芽孢杆菌生物燃料过量生产
摘要：枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物细胞工厂，可以生产有价值的蛋白质和增值化学物质。长片段编辑技术对于加速细菌基因组工程以获得理想且遗传稳定的宿主菌株至关重要。在这里，我们开发了一种有效的CRISPR-CAS9方法，用于枯草芽孢杆菌基因组中的大规模和无疤痕基因组工程，该方法的阳性率为100％，最多可删除高达134.3 kb的DNA片段，是先前报告的3.5倍。还研究了使用异源NHEJ系统，线性供体DNA和各种供体DNA长度对工程效率的影响。然后将CRISPR-CAS9方法用于枯草芽孢杆菌基因组简化和一系列个体和累积的缺失突变体的构建，这些突变体进一步筛选了新一代生物燃料的异丁醇过度生产剂。这些结果表明该方法是一种强大的基因组工程工具，用于构建和筛选具有增强功能的工程宿主菌株，突出了合成生物学和代谢工程的潜力。
针对不动杆菌 1 的高效无疤痕基因组编辑工具包
图 2. 适用于鲍曼不动杆菌 276 AB5075 的基因组编辑策略示意图，用于删除 craA 。质粒特征如图 1 所示。当 277 表示时，LB 琼脂平板补充了 100 mg/L 氨苄青霉素 (Ap)、200 mg/L 阿普霉素 (Apr) 和/或 30 mg/L 亚碲酸盐 (Tel)。为了确认 craA 缺失，使用引物 craA fw seq 和 craA down rv 进行菌落 PCR 279。作为对照，使用野生型 AB5075 280 (WT) 和 pEMGT-craA (p)。M：DNA 分子量标记，条带大小以千碱基 (Kb) 表示。使用 BioRender.com 创建。282
一种用于噬菌体工程的高效，无疤痕，无选择的技术
未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本的版权持有人（本版本发布于5月29日，2021年。; https：//doi.org/10.1101/2021.05.27.4446060 doi：biorxiv Preprint
CRISPR 共编辑策略实现无疤痕同源性......
摘要：成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 通过提供一种简单而强大的方法来切割特定的基因组序列，彻底改变了基因组编辑。然而，在目标位点引入模板化变化通常需要同源定向修复 (HDR)，而这种修复仅在培养的一小部分细胞中起作用。为了富集 HDR 依赖性编辑细胞，我们采用了一种共同编辑策略，即在挽救内源性预制温度敏感 (ts) 突变的同时编辑目标基因 (GOI)。通过使用 ts 突变的修复作为可选择标记，由于编辑会恢复野生型 (wt) 序列，因此选择是“无疤痕的”。为了验证原理，我们使用了 HEK293 和 HeLa 细胞，这些细胞在必需的 TAF1 基因中发生了 ts 突变。 CRISPR 联合编辑 TAF1ts 和 GOI 可使高达 90% 的耐高温细胞携带 GOI 中的所需突变。我们使用该系统插入由质粒供体编码的大盒和由单链寡核苷酸供体 (ssODN) 编码的较小变化。值得注意的是，我们编辑的基因之一是在蛋白酶体亚基 PSMB6 中引入 T35A 突变，从而消除其 caspase 样活性。编辑后的细胞显示出这种活性的特定降低，证明了该系统在生成具有内源基因生物学相关突变的细胞系中的实用性。这种方法提供了一种快速、高效且无疤痕的方法来选择需要 HDR 的基因组编辑细胞。
任何站点附近果蝇基因组的无疤痕工程...
我们描述了一种简单而有效的技术，该技术允许在任何包含倒置ATTP盒的着陆点附近对果蝇基因组序列进行无疤痕的工程，例如模拟插入。这种两步方法结合了PHIC31积分酶介导的位点特异性和归纳核酸酶介导的局部重复分辨率，有效地将原始的着陆点等位基因转换为修改等位基因，仅具有所需的变化。纳入此方法中的主要标记允许在每个步骤中对正确的单个平流进行效率。原则上，单个ATTP站点和FRT站点也是有效的着陆点。鉴于较大且越来越多的着陆点线可用，因此该方法提供了一种简单而快速的方法，可以以无忧的方式对大多数果蝇基因组进行有效编辑。此技术也应适用于其他物种。