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遗传学 利用 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在哺乳动物细胞和小鼠中产生精确的大片段缺失
目前，Cas9 和 Cas12a 系统被广泛用于基因组编辑，但它们精确产生大片段染色体缺失的能力有限。I-E 型 CRISPR 介导广泛和单向的 DNA 降解，但迄今为止，控制 Cas3 介导的 DNA 缺失的大小已被证明是难以捉摸的。在这里，我们证明了 Cas9 的内切酶失活 (dCas9) 可以精确控制哺乳动物细胞中 Cas3 介导的大片段缺失。此外，我们分别报告了使用 CRISPR/Cas3 和 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在小鼠中消除 Y 染色体和精确保留 Sry 基因。总之，dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 介导的精确大片段缺失为通过染色体消除建立动物模型提供了一种方法。该方法也有望成为治疗涉及额外染色体的片段突变或人类非整倍体疾病的潜在治疗策略。
先进的 SPR 应用加速基于片段的药物发现中的命中识别和验证
是分子量为 500 Da 的可能化合物的估计数量。即使与最多 10 6 个分子的工业级小分子库相比，片段库也大大简化了筛选过程。我的研究小组将 FBDD 原则应用于与氧化还原信号、氧化应激和炎症有关的疾病相关蛋白质-蛋白质相互作用。这些靶标在多发性硬化症、中风、肺部炎症、纤维化、类风湿性关节炎和某些癌症等疾病中发挥着重要作用。FBDD 分为两个阶段：1) 片段筛选以确定初始匹配项，2) 随后对这些匹配项进行表征和优化，使其成为真正的线索。我们使用灵敏的生物物理方法，如表面等离子体共振 (SPR) 和基于配体的 NMR，来筛选大约 2,500 个分子的片段库。在此阶段，我们期望低亲和力匹配项处于高微摩尔或低毫摩尔亲和力范围内。然后我们通过更多轮 SPR 测试或其他分析来验证匹配结果，
利用基于结构的方法通过片段支架生长来靶向主要蛋白酶 (Mpro、nsp5)
摘要：SARS-CoV-2 (SCoV2) 的主要蛋白酶 M pro ，nsp5，是其最具吸引力的药物靶点之一。在这里，我们报告了使用核磁共振波谱 (NMR) 对四个不同文库进行的初步筛选数据，以及对从这些文库中获得的有希望的含尿嘧啶片段 Z604 的详细后续合成。Z604 显示出时间依赖性的结合。其抑制作用对还原条件敏感。从 Z604 开始，我们合成并表征了 13 种通过片段增长策略设计的化合物。每种化合物都通过 NMR 和/或活性测定进行表征，以研究它们与 M pro 的相互作用。这些研究产生了四臂化合物 35b，它可直接与 M pro 结合。35b 可以与 M pro 共结晶，揭示其非共价结合模式，从而填充所有四个活性位点亚口袋。在此，我们描述了 NMR 衍生的片段到命中管道及其在开发 SCoV2 主要蛋白酶抑制剂的有希望的起点中的应用。■ 简介
附录 A 每日资源片段
AReM 成员建议提高该工具的透明度。目前，每小时可用性图表和表格按资源类型显示每小时资源贡献。SOD 工具没有一项功能，使 LSE 能够识别其投资组合中哪些资源在给定的小时内可能具有长度，而无需 LSE 手动调整其非存储资源输入以深入了解存储资源可能过剩的地方。LSE 无法通过资源了解其剩余 RA 位置，从而导致 LSE 的投资组合优化效率低下。虽然我们赞赏利用配置文件优化的存储资源的残差计算，但增加粒度将进一步使 LSE 能够评估是否有更有效的方法来满足其现有投资组合的要求。如果 CPUC 可以设计该工具，使 LSE 能够看到其各个资源的长度，那么 LSE 将能够更好地做出有关如何管理其投资组合的有效决策。 AReM 建议添加一个表格，按合同显示每小时资源贡献，这意味着“LSE 显示”选项卡上显示的每一行将以表格形式按小时分段报告。然后，按资源类型汇总的行将加总为“每小时可用性”选项卡中显示的值。这将有利于 LSE 管理其资源组合。例如，如果 LSE 在一天中的 RA 方面表现良好，则表格将更直接地显示合同销售对每小时贡献的影响，而无需手动从工具中减去资源。
基于片段的筛选针对SARS-COV-2主蛋白酶结合口袋的开放形式
PDB参考：SARS-COV-2主要蛋白酶，与CPD-1、7GRE复合；与CPD-2，7GRF复合；与CPD-3，7grg复合；与CPD-4，7GRH复合；与CPD-5，7Gri复合；与CPD-6，7grJ复合；与CPD-7，7grk复合；与CPD-8，7grl复合；与CPD-9，7grm复合；与CPD-10、7grn复合；与CPD-11、7Gro复合；与CPD-12、7GRP复合；与CPD-13、7grq复合；与CPD-14、7GRR复合；与CPD-15，7grs复合；与CPD-16、7grt复合；与CPD-17、7gru复合；与CPD-18、7GRV复合；与CPD-19、7grw复合；与CPD-20，7grx相关；与CPD-21、7Gry配合；与CPD-22、7grz复合；与CPD-23、7GS0复合；与CPD-24、7GS1复合；与CPD-25、7GS2复合；与CPD-26、7GS3复合；与CPD-27、7GS4复合；与CPD-28、7GS5复合；与CPD-29、7GS6
DNA聚合酶i Deinococcus radiodurans的大片段，尖端的室温灯
摘要：近年来，为微生物病原体检测而设计的环路介导的等温扩增（LAMP）技术已获得了生物医学领域的基本重要性，提供了快速而精确的反应。但是，它仍然存在一些缺点，这主要是由于需要达到63℃的恒温块，这是BSTI DNA聚合酶工作温度。在这里，我们报告了DNA聚合酶I大片段的鉴定和表征，该碎片来自deinococcus radiodurans（Dralf-Poli），该片段在室温下起作用，并且对各种环境应力条件有抵抗力。我们证明，Dralf-Poli在广泛的温度和pH值中显示出有效的催化活性，即使在各种应力条件下（包括干燥）存储后，仍保持其活性，并保留其等温扩增技术所需的链排化活性。所有这些特征使Dralf-Poli成为尖端室温灯的绝佳候选者，该灯有望在护理点快速而简单地检测病原体非常有用。
使用 SPR 生物传感器针对具有挑战性的药物靶标进行片段库筛选的多重实验策略
表面等离子体共振 (SPR) 生物传感器方法非常适合基于片段的先导化合物发现。然而，缺乏普遍适用的实验程序和详细方案，尤其是对于结构或物理化学上具有挑战性的靶标或当工具化合物不可用时。成功取决于考虑靶标和化学库的特征，有目的地设计筛选实验以识别和验证具有所需特异性和作用方式的命中物，以及能够确认片段命中物的正交方法的可用性。通过采用多路复用策略、使用多个互补表面或实验条件，可以大大扩展适合基于 SPR 生物传感器的方法识别命中物的目标和库的范围。在这里，我们说明了使用基于流的 SPR 生物传感器系统筛选不同大小（90 和 1056 种化合物）的片段库以针对一系列具有挑战性的靶标的原理和多路复用方法。它展示了识别与下列相互作用的片段的策略：1) 大型和结构动态靶标，以乙酰胆碱结合蛋白 (AChBP) 为代表，AChBP 是一种 Cys 环受体配体门控离子通道同源物；2) 多蛋白复合物中的靶标，以赖氨酸脱甲基酶 1 和辅阻遏物 (LSD1/CoREST) 为代表；3) 结构可变或不稳定的靶标，以法呢基焦磷酸合酶 (FPPS) 为代表；4) 含有内在无序区域的靶标，以蛋白酪氨酸磷酸酶 1B (PTP1B) 为代表；5) 易于聚集的蛋白质，以人类 tau 的工程形式 (tau K18 M ) 为代表。重点介绍了考虑蛋白质和文库特性并提高稳健性、灵敏度、通量和多功能性的实际考虑和程序。研究表明，解决这些类型的目标的挑战不在于识别潜在有用的片段本身，而在于建立验证它们并演变为线索的方法。
无细胞DNA末端基序和片段长度的整合可以鉴定液体活检中的活性基因
摘要：多项研究表明，癌症患者的无细胞DNA（CFDNA）在片段长度和片段末端基序（fem）的差异与健康个体不同，但是缺乏对这两个因素如何与癌症和基因转移相关的如何相关的。在这项研究中，我们使用肺癌患者（n = 12）和健康个体（n = 7）的血浆进行了CFDNA片段组学评估。使用H3K36ME3无细胞染色质染色质免疫沉淀测序（CFCHIP-SEQ）从血浆中建立了一个个人基因表达。与低表达的基因相比，具有最高表达的基因表现出富集短的CfDNA片段（中值= 19.99％，IQR：16.94–27.13％，p <0.0001）。此外，在CFCHIP之后，富含富含GC的FEM。将短CfDNA片段的频率与存在不同的FEM的存在相结合，从而进一步富集了表达最多的基因（中位数= 37.85％，IQR：30.10-39.49％，p <0.0001）。<150 bp cfDNA的体外尺寸选择可以分离代表活性基因的cfDNA，尺寸选择富集与CFCHIP-SEQ富集相关（Spearman R范围：0.499-0.882，p <0.0001）。这项研究扩大了有关CFDNA片段学的知识，并阐明了基因活性与CfDNA片段长度和不同的FEM的相关性的新启示。
一种无需体外处理受精卵的大片段敲入动物生产的新技术
AAVpro 包装质粒 (AAV2，#6234；AAV5，#6664；AA6，#6665，Takara Bio) 和 AAVpro 293T 细胞系 (#632273，Takara Bio)。所有 AAV 载体质粒均通过将对应于目标基因座和敲入序列的 PCR 片段克隆到 EcoRV 和 BglII 限制位点之间的 pAAV-CMV 载体中，去除 CMV 启动子、b-珠蛋白内含子和 hGH polyA 来构建。按照制造商的说明，使用 Xfect 转染试剂 (#631318，Clontech) 将 AAV 质粒和包装质粒转染 293T 细胞。使用 AAVpro 纯化试剂盒 (所有血清型) (#6666，Takara Bio) 提取和浓缩 AAV。使用 AAVpro 滴定试剂盒（#6233，Takara Bio）和热循环仪 Dice 实时系统 III（TP950，Takara Bio）估算病毒基因组拷贝数。