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采用基因疗法治疗输血依赖性地中海贫血的障碍
摘要 β-地中海贫血是最常见的单基因疾病之一。最严重形式的标准治疗，即输血依赖性地中海贫血 (TDT)，需要长期输血和铁螯合治疗，这会带来相当大的医疗、心理和经济负担。来自 HLA 相合供体的异基因造血干细胞移植是一种治愈性治疗方法，对儿童有极好的效果。最近，学术界或行业赞助的临床试验评估了几种基因治疗方法，作为没有 HLA 相合供体的儿童和年轻人的替代治疗选择。通过在自体干细胞中使用自失活慢病毒载体添加功能性 β-珠蛋白基因进行基因治疗，使大多数不同年龄组和基因型的 TDT 患者无需输血，目前随访多年。最近，有报道称，使用成簇的规律间隔短回文重复序列-Cas9 技术编辑的自体造血干细胞治疗 TDT 患者取得了有希望的结果，该技术针对红细胞 BCL11A 表达，BCL11A 表达是从胎儿到成人珠蛋白生成的正常转换的关键调节器。患者达到了高水平的胎儿血红蛋白，从而可以停止输血。尽管临床疗效显著，但 2021 年 TDT 患者获得基因治疗面临两大障碍：(1) 继发性血液系统恶性肿瘤的风险，其来源复杂且由多种因素引起，并不局限于插入诱变的风险，(2) 即使在高收入国家，成本也导致第一种用于 TDT 的基因治疗药物在欧洲的商业化受到阻碍，尽管欧洲药品管理局有条件批准了该产品。 关键词：地中海贫血；造血细胞移植；造血细胞治疗；基因治疗；基因编辑；生活质量
一种无需体外处理受精卵的大片段敲入动物生产的新技术
AAVpro 包装质粒 (AAV2，#6234；AAV5，#6664；AA6，#6665，Takara Bio) 和 AAVpro 293T 细胞系 (#632273，Takara Bio)。所有 AAV 载体质粒均通过将对应于目标基因座和敲入序列的 PCR 片段克隆到 EcoRV 和 BglII 限制位点之间的 pAAV-CMV 载体中，去除 CMV 启动子、b-珠蛋白内含子和 hGH polyA 来构建。按照制造商的说明，使用 Xfect 转染试剂 (#631318，Clontech) 将 AAV 质粒和包装质粒转染 293T 细胞。使用 AAVpro 纯化试剂盒 (所有血清型) (#6666，Takara Bio) 提取和浓缩 AAV。使用 AAVpro 滴定试剂盒（#6233，Takara Bio）和热循环仪 Dice 实时系统 III（TP950，Takara Bio）估算病毒基因组拷贝数。
脊髓状宿主耗尽微生物DNA试剂盒
下列的PCR结果是使用小骨宿主耗尽微生物DNA试剂盒从唾液样品中提取DNA的结果，显示有效的宿主DNA耗竭和微生物DNA恢复。使用QPCR分析，据估计，对于这些样品的宿主DNA耗竭和细菌DNA恢复估计高于90％。图1：使用小骨宿主耗尽微生物DNA试剂盒从唾液样品中提取的DNA的PCR。a）使用人β-珠蛋白引物对宿主DNA检测。b）使用16S引物对细菌DNA检测。m：DNA标记；泳道1、3、5：提取的总DNA，没有执行宿主耗竭步骤；泳道2、4、6：宿主耗尽的（H. dep）DNA使用脊柱状宿主耗尽微生物DNA试剂盒提取；泳道7：PCR阴性对照。
Zynteglo® 和 Casgevy
总体而言，Casgevy™ 的目标是通过一次性治疗改善贫血并实现输血独立性。Casgevy™ 提供基因编辑技术来减少 BCL11A 表达，该基因负责抑制γ珠蛋白和功能性胎儿血红蛋白 (HbF) 的产生。为了帮助身体为治疗做好准备，应在 Casgevy™ 给药前 15 天内进行预处理，包括骨髓消融/化疗和动员疗法。在开始骨髓消融治疗之前，应考虑预防癫痫发作。报告的最常见副作用是粘膜炎、发热性中性粒细胞减少症和食欲下降，以及中性粒细胞减少症、血小板减少症、白细胞减少症、贫血和淋巴细胞减少症。可能需要常规随访实验室工作、监测、感染预防和血细胞支持——可能是长期的。
Biontech Mrna 疫苗 - 病例报告
控制与铁吸收、释放和储存有关的蛋白质表达的系统。众所周知，IRP（铁调节蛋白）通过 IREBP（铁反应元件结合蛋白）与位于其 UTR（5' 非翻译重复序列）中的铁蛋白 mRNA IRE（铁反应元件）结合发挥其生理作用，其中一种可能的结果是激活 NFR2（核因子 [红细胞衍生 2] 样 2）。 NFR2 是一种转录因子，其靶标包括：(1) 参与 β 和 γ 珠蛋白基因转录的基因；(2) 编码两种基因的转录因子的基因，这两种基因又编码两种参与血红蛋白血红素生成的蛋白质：(a) ABCB6 (ATP 结合盒亚家族 B 成员 6)（将卟啉从细胞质运送到线粒体）和 (b) 亚铁螯合酶（将亚铁插入原卟啉 IX）[4,5]。
单个i.v.的体内基础编辑注射载体治疗血红蛋白病
患有β-丘脑贫血或镰状细胞疾病的个体以及具有30％胎儿血红蛋白（HBF）的胎儿血红蛋白（HPFH）的遗传性持久性似乎无症状。在这里，我们使用了非整合HDAD5/35 ++矢量，该矢量表达了腺嘌呤基础编辑器（ABE8E）的高效，准确的版本（在体内安装A –113 A> g HPFH突变中，在健康CD46/β-yac小鼠中含有人β-糖的γ-蛋白启动子中的γ-蛋白启动子中的γ-蛋白启动子。我们的体内造血干细胞（HSC）编辑/选择策略仅涉及S.C.和i.v.注射，不需要骨髓和HSC移植。在CD46/β-YAC小鼠中的体内HSC碱基编辑中导致> 60％–113 A> g转化率，β-蛋白的30％γ-球蛋白在70％的红细胞中表达。 重要的是，未检测到在圆形序列或计算机中预测的位点的脱靶编辑。 此外，RNA-Seq没有发现体内编辑小鼠的转录组的临界变化。 在体外，在β-thal症和镰状细胞疾病患者的HSC中，基本编辑器载体介导的有效效率–113 A> g转化和γ-珠蛋白表达的重新激活，并随后对等肌酸细胞的表型校正。 由于我们的体内基础编辑策略在技术上是安全且技术简单的，因此它具有流行血红蛋白病的发展中国家的临床应用。导致> 60％–113 A> g转化率，β-蛋白的30％γ-球蛋白在70％的红细胞中表达。重要的是，未检测到在圆形序列或计算机中预测的位点的脱靶编辑。此外，RNA-Seq没有发现体内编辑小鼠的转录组的临界变化。在体外，在β-thal症和镰状细胞疾病患者的HSC中，基本编辑器载体介导的有效效率–113 A> g转化和γ-珠蛋白表达的重新激活，并随后对等肌酸细胞的表型校正。由于我们的体内基础编辑策略在技术上是安全且技术简单的，因此它具有流行血红蛋白病的发展中国家的临床应用。
EDIT-301 计划更新 RUBY 和 EdiTHAL 试验数据...
HBB，β-珠蛋白基因；HbSS，镰状细胞突变纯合子；HCT，造血细胞移植；RBC，红细胞；SCD，镰状细胞病；VOE，血管闭塞事件。1. Kato GJ 等人。2018 年 Nat Rev Dis Primers；4：18010。2. Williams TN 等人。2018 年 Annu Rev Genomics Hum Genet；19：113–147。3. Platt OS 等人。1994 年 NEJM；330：1639–44。4. 镰状细胞病。可访问以下网址：https://www.thelancet.com/pb-assets/Lancet/gbd/summaries/diseases/sickle-cell-disorders.pdf。访问时间：2023 年 6 月。5. Wastnedge E 等人。J Glob Health 2018；8 (2): 021103。6. 镰状细胞病。可访问网址：https://www.nhlbi.nih.gov/health/sickle-cell-disease。访问时间：2023 年 6 月。8
用于研究HIV-1和...
H37RV-MCHERRY包含携带RV2170的综合质粒（PVV16），该质粒从HSP60启动子（美国康奈尔大学，美国康奈尔大学）的良好礼物中构成表达。根据标准程序生成生长曲线。在7H9液体培养基（7H9肉汤中，补充了0.05％[v/v] tween-80，0.2％[V/V]甘油，在37°C下，在37°C的37°C下对结核分枝杆菌H37RV-MCHERRY的等分试样进行有氧培养。培养物的光密度以每24小时600nm的速度测量7天。并行，通过在固体培养基上的连续稀释和接种（Middlebrook 7H11琼脂）列举了菌落形成单位（CFU），并补充了10％油酸 - α-α-珠蛋白 - 脱蛋白 - 脱蛋白– dextrose-catalase，0.2％[V/V]甘油和0.05％[V/V/V/V] [V/V] tweeen-80）。培养物保持在中期阶段，并根据生长曲线调整了感染的浓度。
UCLA 先前出版的作品
90095，美国。 * 通讯作者电子邮件：ana@chem.ucla.edu 摘要。为了解开为什么计算设计无法产生可行的酶，而定向进化 (DE) 却能成功，我们的研究深入研究了原珠蛋白的实验室进化。DE 已经使这种蛋白质适应了有效地催化卡宾转移反应。我们表明，之前提出的增强底物接近和结合本身不能解释 DE 期间产量的增加。通过蛋白质动力学跟踪整个活性位点的 3D 电场，使用亲和力传播算法进行聚类，并进行主成分分析。该分析揭示了 DE 中电场的显著变化，其中不同的场拓扑影响过渡态能量和机制。在 DE 期间，一个具有化学意义的场成分出现并占据主导地位，并有助于跨越卡宾转移障碍。我们的研究结果强调了内在电场动态对酶功能的影响、场在同一蛋白质内切换机制的能力以及场在酶设计中的关键作用。简介
人造血干细胞的体内编辑治疗蛋白的红细胞表达
有针对性的基因组编辑具有治疗需要蛋白质替代疗法的疾病的巨大治疗潜力。为了开发独立于特定患者变形的平台，可以将治疗转基因插入安全且高度转录的基因座，以最大程度地提高蛋白质表达。在这里，我们描述了一种实现人类造血干/祖细胞（HSPCS）中有效基因靶向有效基因的方法，并通过红细胞动力学谱系对临床相关蛋白质的鲁棒表达。使用CRISPR-CAS9，我们在内源性α-珠蛋白启动子的转录控制下整合了不同的转基因，从而概括了其高和红细胞的特异性表达。源自靶向HSPC的促成的细胞分泌不同的治疗蛋白，该蛋白保留了酶活性和交叉校正患者细胞。此外，修饰的HSPC在移植小鼠中保持长期重生和多系分化潜力。总的来说，我们为不同的治疗应用（包括血友病和遗传的代谢疾病）建立了一个安全且通用的基于CRISPR-CAS9的HSPC平台。