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World File Search System胞嘧啶
使用 CRISPR/Cas9 胞嘧啶碱基编辑工具箱对利什曼原虫进行基因编辑和可扩展的功能基因组筛选 LeishBASEedit
摘要 CRISPR/Cas9 基因编辑彻底改变了利什曼病的病原体利什曼原虫的功能丧失实验。然而，由于利什曼原虫缺乏功能性非同源 DNA 末端连接途径，因此获得无效突变体通常需要额外的供体 DNA、选择与药物耐药性相关的编辑或耗时的克隆分离。因此，目前无法在不同条件下和多种利什曼原虫物种中进行全基因组功能丧失筛选。在这里，我们报告了一个克服这些限制的 CRISPR/Cas9 胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 工具箱。我们利用利什曼原虫中的 CBE 通过将胞嘧啶转化为胸腺嘧啶来引入终止密码子，并创建了用于动基体中 CBE 引物设计的 http://www.leishbaseedit.net/。通过报告基因检测以及针对 L. mexicana 、 L. major 、 L. donovani 和 L. infantum 中的单拷贝和多拷贝基因，我们展示了该工具如何通过仅表达一个单向导 RNA 来有效生成功能性无效突变体，在非克隆群体中达到高达 100% 的编辑率。然后，我们生成了针对利什曼原虫优化的 CBE，并成功地针对质粒文库传递的 L. mexicana 中的功能丧失筛选中的必需基因。由于我们的方法不需要 DNA 双链断裂、同源重组、供体 DNA 或克隆分离，我们相信这首次使通过质粒文库传递在利什曼原虫中进行功能性遗传筛选成为可能。
DNA重组技术中使用的主要酶
DNA甲基转移酶是一类催化DNA中核苷酸残基甲基化的酶。甲基转移酶的活性包括将甲基（CH3-）基团转移到DNA中的含氮碱基胞嘧啶上，这会导致DNA性质的改变，同时相应基因的活性和功能以及核酸的空间结构（构象）也会发生变化
实验性种子去甲基化后的长期甲基化组变化及其与香叶草（Geraniaceae）中反复水分胁迫的相互作用
• 全球亚热带和温带地区干旱期的频率和长度正在增加。表观遗传对水分胁迫的反应可能是植物抵御这些难以预测的挑战的关键。实验性 DNA 去甲基化与应激因子的应用相结合是揭示表观遗传学对植物应激反应贡献的适当策略。• 在温室中，我们分析了用 5-氮杂胞苷对种子进行去甲基化和/或反复受水胁迫后，一年生地中海草本植物 Erodium cicutarium 成年植株叶片胞嘧啶甲基化的变化。我们使用亚硫酸盐 RADseq (BsRADseq) 和新报道的 E. cicutarium 参考基因组，以 2 9 2 因子设计表征甲基化变化，控制植物相关性。 • 从长期来看，仅用 5-氮杂胞苷处理会导致单个胞嘧啶的低甲基化和高甲基化，在 CG 环境中会出现显著的低甲基化。在对照条件下，干旱导致除 CHH 环境中所有环境中的甲基化减少。相反，经历反复水胁迫并用 5-氮杂胞苷处理的植物的基因组使 DNA 甲基化水平增加约 5%。• 种子去甲基化和反复干旱在整体和特定环境中的胞嘧啶甲基化方面产生了高度显著的相互作用。大多数甲基化变化发生在基因区域周围和转座因子内。这些与基因相关的差异甲基化区域的注释包括几个在应激反应中具有潜在作用的基因（例如 PAL、CDKC 和 ABCF），证实了表观遗传在分子水平上应对应激的贡献。
DNA 甲基化动力学是非洲爪蟾蝌蚪脑中变态基因调控程序的基础
DNA 中胞嘧啶残基的甲基化会影响染色质结构和基因转录，其调控对大脑发育至关重要。越来越多的证据表明，DNA 甲基化可受激素信号调节。我们分析了变态过程中 Xenopus 蝌蚪大脑中 DNA 甲基化的全基因组变化及其与基因调控的关系，变态是一个依赖甲状腺激素的发育过程。我们研究了蝌蚪大脑中含有控制垂体激素分泌的神经分泌神经元的区域，该区域对甲状腺激素作用高度敏感。使用甲基化 DNA 捕获测序 (MethylCap-seq)，我们发现了整个蝌蚪神经细胞基因组中 DNA 甲基化的多样化景观，成对阶段比较确定了数千个差异甲基化区域 (DMR)。在变态前期至变态前期，DMR 的数量最低 (1,163)，去甲基化占主导地位。从变态前期到变态高潮期，DMR 几乎翻了一番（2,204），甲基化占主导地位。DNA 甲基化的最大变化出现在变态高潮期到变态完成期（2960 个 DMR），其中 80% 的 DMR 代表去甲基化。使用 RNA 测序，我们发现差异表达基因与位于基因体和转录起始位点上游区域的 DMR 之间存在负相关性。MethylCap-seq 揭示的变态期 DNA 去甲基化通过 DNA 去甲基化中间体 5-羟甲基胞嘧啶和 5-羧甲基胞嘧啶以及催化 DNA 去甲基化的甲基胞嘧啶双加氧酶十十一易位 3 的免疫反应性增加得到证实。我们的研究结果表明，蝌蚪神经细胞的基因组在变态过程中会发生显著的 DNA 甲基化变化，这些变化可能会影响染色质结构和此发育时期发生的基因调控程序。
全基因组DNA甲基化分析揭示了具有不同类型的尾巴
在哺乳动物中，DNA甲基化是指在DNA-甲基转移酶（DNMT）的作用下用S-腺苷甲基氨酸（SAM）供应甲基，将其甲基转移到甲基环胞嘧啶环的第5个碳原子中，形成甲基化的甲基化脱氧糖苷（5MC）（5MC）（5MC）（5MC）。5MC通常出现在CpG的胞嘧啶上，CpG位点可以占哺乳动物基因组的5–10％。CpG的甲基化状态与基因表达密切相关，DNA甲基化可以抑制辅助基因的活性，而脱甲基化可以诱导基因重新表达。表型差异并不能完全解释遗传差异，研究表明，DNA甲基化可以解释表型差异，例如双胞胎，克隆动物的表型差异（6-8）。DNA甲基化主要通过调节与脂肪细胞分化，转录辅助因子和与脂肪代谢相关的转录因子的表达来调节脂肪组织的生长和发育（9）。张张已经表明，基因启动子区域的甲基化可能抑制与脂肪代谢相关的基因的表达，从而影响脂质液滴结构和脂肪沉积（10）。
使用工程化的 APOBEC3G 进行单个 C 到 T 替换...
胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 能够在目标基因座上实现有效的胞嘧啶到胸苷 (C-to-T) 替换，而不会造成双链断裂。然而，目前的 CBE 会编辑其活动窗口内的所有 C，从而产生不良的旁观者突变。在最具挑战性的情况下，当旁观者 C 与目标 C 相邻时，现有的碱基编辑器无法区分它们并编辑两个 C。为了提高 CBE 的精度，我们识别并设计了人类 APOBEC3G (A3G) 脱氨酶；当与 Cas9 切口酶融合时，所得的 A3G-BE 会在人类细胞中对 5′-CC-3′ 基序中的第二个 C 进行选择性编辑。我们的 A3G-BE 可以高精度地安装单个与疾病相关的 C-to-T 替换。与 BE4max 相比，完美修饰等位基因的百分比在疾病校正方面高出 6000 倍以上，在疾病建模方面高出 600 倍以上。基于双细胞胚胎注射方法和 RNA 测序分析，我们的 A3G-BE 表现出最小的基因组和转录组范围的脱靶效应，实现了高靶向保真度。
克隆，表征和表达的大肠杆菌中的CpG DNA甲基酶的基因中的大肠杆菌中的克隆，表征和表达。菌株MQ1（M SSSI）
摘要我们在这里描述了从螺旋体SP中编码DNA甲基化酶的基因大肠杆菌中的克隆，表征和表达。菌株MQ1（M * SSSI）。该酶完全和仅CPG序列（1）。使用其自身的启动子在E.盘管中转录螺旋质基因。整个消息的翻译需要使用蛋白石抑制器，这表明UGA三胞胎代码用于螺旋形的色氨酸代码。对基因的序列分析在1158 bp的长开放式阅读框架中揭示了几个UGA三胞胎。在M SSSI中揭示的推导的氨基酸序列所有共同结构域的特征是细菌胞嘧啶DNA甲基酶的特征。尽管具有共同的序列特异性，但M SSSI的推定序列识别域与小鼠DNA甲基化酶的相似性没有明显的相似性。克隆的甲基化酶在体内和体外均仅CpG序列。与主要是维持甲基酶的哺乳动物酶相比，MSSI显示了从头开始的甲基化酶活性，这是原核生物胞嘧啶DNA甲基化酶的特征。
宿主限制因子 APOBEC3 在人类病毒基因组上的足迹
APOBEC3 酶是先天免疫效应物，可将突变引入病毒基因组。这些酶是胞嘧啶脱氨酶，可将胞嘧啶转化为尿嘧啶。它们优先突变胞嘧啶，然后突变胸腺嘧啶，使 5'TC 基序成为它们的首选目标。病毒已经进化出不同的策略来逃避 APOBEC3 的限制。某些病毒会主动编码对抗 APOBEC3 的病毒蛋白，而另一些病毒则会被动面对 APOBEC3 的选择压力，因为 APOBEC3 靶向基序的基因组已经耗尽。因此，APOBEC3 在某些病毒的基因组上留下了进化的足迹。我们研究的目的是识别这些具有由 APOBEC3 塑造的基因组的病毒。我们分析了 33,400 种人类病毒的基因组，以了解 APO-BEC3 青睐的基序是否耗尽。我们证明 APOBEC3 选择压力影响至少 22% 的目前已注释的所有人类病毒物种。乳头瘤病毒科和多瘤病毒科是足迹最密集的家族；证明选择压力作用于全基因组和两条链。细小病毒科成员在足迹的大小和定位方面具有不同的目标。有趣的是，B19 红细小病毒的两条链上都存在大量 APOBEC3 足迹；这使得该病毒基因组成为 APOBEC3 青睐基序最干净的序列之一。我们还发现地方性冠状病毒科具有显著的足迹。有趣的是，在人畜共患的 MERS-CoV、SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 冠状病毒上未检测到这样的足迹。除了全基因组足迹的病毒外，某些病毒仅在其基因组的很短部分上留下足迹。这种情况对于γ-疱疹病毒科和腺病毒科来说就是如此，它们的足迹位于裂解性复制起点上。在逆转录的 HIV- 1、HIV-2、HTLV-1 和 HBV 病毒的负链上也可以检测到轻微的足迹。总之，我们的数据说明了 APOBEC3 对人类病毒的选择压力程度，并确定了新的假定 APOBEC3 靶向病毒。
继承的分子基础
DNA和RNA世界：1。在门德尔（Mendel）之后的几年中，研究了遗传物质的性质，从而意识到DNA是大多数生物中的遗传物质。2。脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）是活体系中发现的两种核酸。核酸是核苷酸的聚合物。3。DNA在大多数生物体中充当遗传物质，而RNA在某些病毒中充当遗传物质。4。RNA主要用作Messenger。RNA具有其他功能作为衔接子，结构或催化分子。 5。 多核苷酸链的结构（i）核苷酸具有三个部分，即 氮基，五糖糖（DNA中的脱氧核糖，RNA中的核糖）和磷酸基团。 （ii）氮碱是嘌呤，即 腺嘌呤，鸟嘌呤和嘧啶，即 胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶。 （iii）胞嘧啶在DNA和胸腺氨酸中都存在于DNA中。 尿嘧啶存在于胸腺嘧啶位置的RNA中。 （iv）氮基碱通过N-糖苷键连接到五糖糖，形成核苷，即 腺苷和鸟嘌呤等。 （v）当磷酸基团通过磷酸二酯键连接到核苷的5' - OH时，形成了相应的核苷酸。 （vi）两个核苷酸通过3' - > 5'磷酸二酯键连接以形成二核苷酸。 （vii）可以连接几个核苷酸以形成多核苷酸链。 （x）基碱对彼此互补。RNA具有其他功能作为衔接子，结构或催化分子。5。多核苷酸链的结构（i）核苷酸具有三个部分，即氮基，五糖糖（DNA中的脱氧核糖，RNA中的核糖）和磷酸基团。（ii）氮碱是嘌呤，即腺嘌呤，鸟嘌呤和嘧啶，即胞嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶。（iii）胞嘧啶在DNA和胸腺氨酸中都存在于DNA中。尿嘧啶存在于胸腺嘧啶位置的RNA中。（iv）氮基碱通过N-糖苷键连接到五糖糖，形成核苷，即腺苷和鸟嘌呤等。（v）当磷酸基团通过磷酸二酯键连接到核苷的5' - OH时，形成了相应的核苷酸。（vi）两个核苷酸通过3' - > 5'磷酸二酯键连接以形成二核苷酸。（vii）可以连接几个核苷酸以形成多核苷酸链。（x）基碱对彼此互补。（viii）多核苷酸链中的主链由于糖和磷酸盐而形成。（ix）与主链糖部分相关的氮基碱基。6。在RNA的情况下，每个核苷酸残基都有一个额外的OH组，核糖中的2位位于核糖中。另外，在胸腺氨酸（5-甲基尿嘧啶）的位置也发现了尿嘧啶。