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测量高纤维干菊苣根对中高风险皮肤黑色素瘤患者肠道菌群的影响：一项探索性研究
中高危皮肤黑色素瘤 (T3/T4) 接受手术治疗后，约 30-50% 的病例会在 5 年内复发。肠道微生物群由生活在肠道中的细菌和其他微生物组成，已被确定为接受免疫检查点抑制治疗的 IV 期黑色素瘤患者的治疗靶点。有趣的是，在中高危皮肤黑色素瘤（最低为 II A 期）中，经常会发现肿瘤浸润淋巴细胞，有时会导致这些肿瘤自发缓解。因此，探索该患者组的肠道微生物组成和肠道微生物群的调节能力以了解肠道微生物群是否能够在增强免疫系统功能方面发挥作用是有益的。膳食纤维可以调节肠道微生物组成，从而有利于能够产生短链脂肪酸 (SCFA) 的细菌。据推测，这些 SCFA 对免疫细胞组成、粪便钙卫蛋白水平、排便方式和整体健康有有益影响。
比较三种不同递送方法在菊苣中实现 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑。
菊苣根 ( Cichorium intybus L. var. sativum ) 用于提取菊粉，菊粉是一种用作天然甜味剂和益生元的果糖聚合物。然而，在菊粉提取过程中需要去除味道苦涩的倍半萜内酯，而菊苣正是因为这种内酯才具有其独特的风味。为了避免这种提取过程及其相关成本，最近通过灭活四个拷贝的 germacrene A 合酶基因 ( CiGAS-S1、-S2、-S3、-L )，创建了倍半萜内酯含量较低的菊苣变种，该基因编码的酶可启动菊苣中苦味倍半萜内酯的生物合成。在本研究中，对 CRISPR/Cas9 试剂的不同递送方法进行了比较，比较了它们在 CiGAS 基因中诱导突变的效率、脱靶突变的频率以及它们对环境和经济的影响。 CRISPR/Cas9 试剂通过农杆菌介导的稳定转化或使用相同 sgRNA 的质粒或预组装核糖核酸复合物 (RNP) 瞬时递送。所有使用的方法都会导致 CiGAS -S1 和 CiGAS -S2 基因中出现大量 INDEL 突变，这些基因与所用的 sgRNA 完全匹配；此外，与 sgRNA 有一个错配的 CiGAS -S3 和 CiGAS -L 基因也发生了突变，但突变效率较低。虽然使用 RNP 和质粒递送会导致双等位基因、杂合或纯合突变，但质粒递送会导致 30% 的质粒片段在基因组中不必要地整合。通过农杆菌转化的植物通常表现出嵌合现象和 CiGAS 基因型的混合。当植物生长较长时间时，这种基因镶嵌变得更加多样化。虽然瞬时和稳定递送方法中靶基因型各不相同，但在六种已识别的潜在脱靶中未发现脱靶活性，这些脱靶存在两到四个错配。这些方法对环境的影响（温室气体 (GHG) 排放和一次能源需求）在很大程度上取决于它们各自的电力需求。从经济角度来看 - 就像大多数研究和开发一样
CRISPR/Cas9 靶向抑制菊苣中的木香烃内酯合成酶，导致木香烃内酯及其结合物在主根中积累
菊苣主根积累倍半萜内酯乳酸素、乳苦素和 8-脱氧乳酸素，主要以草酸形式存在。菊苣倍半萜内酯的生物合成途径仅部分阐明；将法呢基焦磷酸转化为木香烃内酯的酶已被描述。木香烃内酯转化为三环结构愈创木香烃内酯的下一个生物合成步骤，迄今为止在菊苣中尚未阐明。在这项研究中，在菊苣中发现了三种假定的木香烃内酯合酶基因，分别名为 CiKLS1、CiKLS2 和 CiKLS3。使用酵母微粒体测定法在体外证明了它们将木香烃内酯转化为木香烃内酯的活性。接下来，将 CRISPR/Cas9 试剂引入菊苣原生质体，以灭活多个菊苣 KLS 基因，并成功再生了几个菊苣品系。通过 CRISPR/Cas9 方法灭活菊苣中的 kauniolide 合酶基因，导致菊苣叶和主根中倍半萜内酯的生物合成中断。在菊苣主根中观察到木香烃内酯及其结合物的积累量很高，即 1.5 mg/g FW，但在叶子中没有。这些结果证实，尽管程度不同，但所有这三个基因都有助于 STL 的积累。这些观察结果表明，菊苣基因组上串联的三个基因编码 kauniolide 合酶，可启动菊苣中木香烃内酯向倍半萜内酯的转化。