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World File Search System诱变
微生物多个染色体区域的定向诱变
定向进化可以有效地改造蛋白质、生物合成途径和细胞功能。传统的基于质粒的方法通常对一个或偶尔多个感兴趣的基因进行诱变，需要耗时的人工干预，并且进行诱变的基因在其原生基因组背景之外。其他方法不加选择地诱变整个基因组，这可能会扭曲结果。最近的重组工程和基于 CRISPR 的技术通过允许在其原生基因组背景下的多个预定位点上实现极高的突变率，从根本上改变了这一领域。在这篇综述中，我们重点介绍了最近的技术，这些技术可能允许在这些目标序列的原生基因组背景下在多个基因组位点上加速可调诱变。这些技术将通过四个主要标准进行比较，包括诱变规模、对多种微生物物种的可移植性、脱靶诱变和成本效益。最后，我们讨论这些技术进步如何为基础研究和生物技术开辟新的途径。
crispr/cas9介导的VVMLO3诱变会增强葡萄藤（Vitis Vinifera）对白粉病的耐药性
摘要葡萄（Vitis Vinifera）是世界上最重要的水果作物之一，遭受了白粉病的产量损失，这是由Erysiphe Necator引起的主要真菌疾病。除了抑制宿主免疫外，植物病原体还调节宿主蛋白所称为易感性因素以促进其在植物中的增殖。在这项研究中，CRISPR/CAS9（群集定期间隔短的短文重复序列/CRISPR相关9）技术用于使MLO的靶向诱变（霉菌抗性基因座O）家族基因被认为是粉状霉菌真菌的S因子。在两个或两个葡萄树Mlo基因VVMLO3和VVMLO4的等位基因中诱导的小缺失或插入，在粉状霉菌敏感的品种Thompson无生物的转基因植物中。使用不同的CRISPR/CAS9构建体获得的编辑效率从0％到38.5％不等。在获得的20个VVMlo3/4编辑的线中，一个是单个突变的纯合子，三个备有的双重突变，突变中有7个是杂合的，九个是嵌合，嵌合是嵌合，如每个线路中有两个以上突变的等位基因所示。在20个VVMLO3/4编辑的葡萄藤线中，有6条显示出正常的生长，而其余的线则表现出衰老样的氯症和坏死。重要的是，四个VVMLO3编辑线显示出对白粉病的耐药性，这与宿主细胞死亡，细胞壁的伴侣（CWA）和H 2 O 2积累有关。综上所述，我们的结果表明，CRISPR/CAS9基因组编辑技术可成功地用于诱导感兴趣基因的靶向突变，以提高经济重要性的特征，例如葡萄藤中的抗病性。
基于 CRISPR-Cas9 的毛霉菌诱变......
摘要：Lichtheimia corymbifera 被认为是最常见的毛霉菌之一。由于缺乏有效的基因操作工具，我们无法表征这种机会性致病真菌的致病机制和毒力因子。尽管此类技术已用于某些物种，但在毛霉目真菌中，进行定向诱变和构建稳定转化体仍然是一个巨大的挑战。在本研究中，应用无质粒 CRISPR-Cas9 系统对 L. corymbifera 进行定向基因破坏。所述方法基于 Cas9 酶引起的双链断裂的非同源末端连接修复。利用该方法，可以在乳清苷 5′-磷酸脱羧酶基因 (pyrG) 中诱导一到五个核苷酸长的短靶向缺失，从而构建尿嘧啶营养缺陷型菌株。这些菌株可作为未来基因操作研究中的受体菌株。据我们所知，这是这种临床相关真菌的首次基因改造。
基于 CRISPR-Cas9 的毛霉菌诱变......
摘要：Lichtheimia corymbifera 被认为是最常见的毛霉菌之一。缺乏有效的基因操作工具阻碍了对这种机会性致病真菌的致病机制和毒力因子的鉴定。尽管此类技术已在某些物种中得到描述，但在毛霉目真菌中，进行定向诱变和构建稳定的转化子仍然是一个巨大的挑战。在本研究中，应用无质粒的 CRISPR-Cas9 系统对 L. corymbifera 进行定向基因破坏。所述方法基于 Cas9 酶引起的双链断裂的非同源末端连接修复。利用该方法，可以在乳清苷 5'-磷酸脱羧酶基因 (pyrG) 中诱导一到五个核苷酸长的短靶向缺失，从而构建尿嘧啶营养缺陷型菌株。这些菌株可作为未来基因操作研究中的受体菌株。据我们所知，这是这种临床相关真菌的首次基因改造。
TIM，一种利用 CRISPR/Cas9 在莱茵衣藻中进行的定向插入诱变方法
突变体的产生和随后的分析对于理解基因和蛋白质的功能至关重要。在这里，我们描述了 TIM，一种高效、经济、基于 CRISPR 的针对模型生物莱茵衣藻的靶向插入诱变方法。TIM 利用 Cas9 引导 RNA (gRNA) 核糖核蛋白 (RNP) 与外源双链（供体）DNA 一起递送到细胞中。供体 DNA 包含基因特异性同源臂和一个完整的抗生素抗性基因，该基因插入由 Cas9 产生的双链断裂处。在优化该方法的多个参数后，我们能够在两种不同的细胞壁菌株中为六种不同基因中的六种产生突变体，突变效率范围为 40% 到 95%。此外，这些高效率允许在单个实验中同时靶向两个不同的基因。 TIM 在许多参数方面都很灵活，可以使用电穿孔或玻璃珠法来传递 RNP 和供体 DNA。TIM 在 C . reinhardtii 中实现的突变率远高于之前报道的任何基于 CRISPR 的方法，并且有望对许多（如果不是全部）非必需核基因有效。
![高通量 CRISPR/Cas9 诱变简化玉米性状基因识别[OPEN]](/simg/2/2f10bf92fd3f26433701798d1c7b2db89ccc2423.webp)
高通量 CRISPR/Cas9 诱变简化玉米性状基因识别[OPEN]
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果蝇组织特异性 CRISPR 诱变的大规模资源
摘要 基因筛选是基因组功能注释的有力工具。在多细胞生物中，允许在空间和时间上控制基因消除的方法极大地促进了基因功能的探究。在这里，我们描述了一个大规模转基因短向导 (sg) RNA 文库，用于以组成性或条件性方式有效地基于 CRISPR 破坏特定靶基因。该文库目前由 2600 多个质粒和 1700 个果蝇系组成，重点是靶向激酶、磷酸酶和转录因子，每个都在 Gal4/UAS 系统的控制下表达两个 sgRNA。我们表明，条件性 CRISPR 诱变在许多靶基因中都很有效，并且可以有效地用于各种体细胞组织以及生殖系。为了防止通常与过量 Cas9 蛋白相关的假象，我们开发了一系列新型 UAS-Cas9 转基因，这些转基因允许对 Cas9 表达进行微调，以实现高基因编辑活性，而不会产生可检测的毒性。功能测定以及基因组 sgRNA 靶位点的直接测序表明，绝大多数转基因 sgRNA 系可介导有效的基因破坏。此外，我们在所有后生动物中进行了迄今为止最大的完全转基因 CRISPR 筛选，这进一步证明了我们文库的高效率和准确性，并揭示了许多迄今为止尚未鉴定的发育必需基因。
大麦脑膜炎黄杆菌脯氨酰寡肽酶和谷氨酰胺特异性内肽酶的定向诱变
小麦麸质蛋白是已知的乳糜泻病因。这些蛋白质中脯氨酸和谷氨酰胺残基的重复序列使其在胃肠道中具有极强的抗消化性。这些未消化的肽会引发易感个体的免疫反应，这可能是过敏反应或乳糜泻。麸质排除饮食是此类疾病的唯一获批疗法。最近，大麦中的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶 (EP-B2) 和脑膜炎黄杆菌中的脯氨酰内切肽酶 (Fm-PEP) 的组合在小麦胚乳中表达时，在模拟胃肠道条件下被证明可以合理地解毒免疫原性麸质肽。尽管这些“麸质酶”很有用，但它们的应用受到限制，因为它们在高温下会变性，而大多数食品加工都需要高温。这些酶的变体来自嗜热生物，但由于其最佳活性在高于 37 ◦ C 的温度下存在，因此不能直接应用。不过，这些酶可以作为参考，指导中温来源的肽酶向热稳定性进化。因此，这里使用序列引导的位点饱和诱变方法在编码 Fm-PEP 和 EP-B2 的基因中引入突变。使用这种方法鉴定出能够在高达 90 ◦ C 的温度下存活的 Fm-PEP 的热稳定性变体和热稳定性高达 60 ◦ C 的 EP-B2 变体。然而，达到的热稳定性水平还不够；本研究提供了可以提高谷蛋白酶热稳定性的证据。并且这项初步研究为未来更详细的结构研究奠定了基础，以获得可以在 ∼ 100 ◦ C 温度下存活的 Fm-PEP 和 EP-B2 变体，从而可以将其包装在谷物中并将此类谷物用于食品工业。