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两种品系助力蓝莓实现 FasTrack 育种
摘要。蓝莓幼苗的幼年期通常持续 3 至 4 年。为了缩短这一时期并促进 FasTrack 育种，我们开发了转基因“ Aurora ”蓝莓植物，该植物具有蓝莓 FLOWERING LOCUS T 基因的组成性表达，使 T 0 转化体在短短 1 年内开花。为了评估这些转基因系在加速育种周期方面的潜力，我们将转基因“ Aurora ”与转基因南部高丛蓝莓“ Legacy ”杂交，称为 Mu-Legacy。Mu-Legacy 也表现出早期开花，这主要是由于转基因插入，使其适合 FasTrack 育种。经过 2 年多的表型分析，我们观察到转基因幼苗每年都会持续开花，而非转基因幼苗则不会开花。这些结果表明，无论是蓝莓 FLOWERING LOCUS T 基因的组成性表达，还是转基因“Legacy”中的特定转基因插入位点，都可以有效缩短蓝莓植物的幼年期。鉴于“Aurora”和“Legacy”在蓝莓生产中的重要性，这些转基因品系将成为加速蓝莓育种计划的宝贵工具。
酵母杀伤毒素K2的信号序列赋予生产者的自我保护，并允许转换为模块化毒素 - 抗毒素系统
图1。N末端区域在K2免疫力中的重要性。 a）16个删除构建体的概述，每个删除构建体缺少K2 ORF内的区域（14-27密码子）（不绘制为刻度）。 将切除的段替换为编码Pro-Ala-Gly的框架内SBFI限制性位点，并将其放置在PRS423型载体上的GAL1半乳糖诱导启动子后面。 酵母转化后，在诱导含有1％半乳糖的培养基中培养了三种转化体，然后转移到补充10 A.U.的新鲜诱导培养基中。 K2毒素。 b）在24小时的过程中，在板块读取器中记录了毒素中的OD 600。 条形表示生物学三份的最终OD 600值的平均值，误差线表示±1标准偏差。 单个重复值显示为点。 wt：野生型K2，控制：空矢量。 c）该表提供了有关系统删除构建体的修改区域的第一个也是最后一个删除的密码子的信息。 请注意，第一个构造还省略了位置1的起始密码子。N末端区域在K2免疫力中的重要性。a）16个删除构建体的概述，每个删除构建体缺少K2 ORF内的区域（14-27密码子）（不绘制为刻度）。将切除的段替换为编码Pro-Ala-Gly的框架内SBFI限制性位点，并将其放置在PRS423型载体上的GAL1半乳糖诱导启动子后面。酵母转化后，在诱导含有1％半乳糖的培养基中培养了三种转化体，然后转移到补充10 A.U.的新鲜诱导培养基中。K2毒素。 b）在24小时的过程中，在板块读取器中记录了毒素中的OD 600。 条形表示生物学三份的最终OD 600值的平均值，误差线表示±1标准偏差。 单个重复值显示为点。 wt：野生型K2，控制：空矢量。 c）该表提供了有关系统删除构建体的修改区域的第一个也是最后一个删除的密码子的信息。 请注意，第一个构造还省略了位置1的起始密码子。K2毒素。b）在24小时的过程中，在板块读取器中记录了毒素中的OD 600。条形表示生物学三份的最终OD 600值的平均值，误差线表示±1标准偏差。单个重复值显示为点。wt：野生型K2，控制：空矢量。c）该表提供了有关系统删除构建体的修改区域的第一个也是最后一个删除的密码子的信息。请注意，第一个构造还省略了位置1的起始密码子。
基于共编辑1策略2的T0代植物高效无转基因基因组编辑
对 T0 代植物进行无转基因基因组编辑是人们非常希望实现的目标，但同时也极具挑战性，尤其是在多年生植物和无性繁殖植物中。在这里，我们研究了通过农杆菌介导的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)/gRNA-Cas12a/crRNA-GFP 在植物体内瞬时表达来生成无转基因基因编辑植物的共编辑策略。具体而言，12 CBE/gRNA 用于碱基编辑 ALS 基因，从而赋予对除草剂氯磺隆的抗性，作为 13 选择标记，该抗性对植物表型没有负面影响；Cas12a/crRNA 用于编辑感兴趣的基因；GFP 用于选择无转基因转化子。使用 15 这种方法，可以在 T0 代中高效地针对番茄、烟草、马铃薯和柑橘中的各种基因 16 (单个或多个) 生成无转基因基因组编辑植物。除草剂抗性转化体中靶基因的双等位基因/纯合无转基因突变率在 8% 至 50% 之间。全基因组测序进一步证实了编辑植物中无转基因和无脱靶突变。共编辑策略对于在 T0 代中产生无转基因、基因组编辑植物是有效的，因此是植物遗传改良的有力工具。
用于生产2-苯基乙醇的代谢和酶促工程方法
2-苯基乙醇以其玫瑰般的气味和抗菌活性而闻名，通过苯基丙酮酸脱羧酶（PDC）和醛还原酶的顺序反应通过外源苯基丙酮酸合成。我们首先靶向ARO10，这是酿酒酵母的苯基丙酮酸脱羧酶基因，并鉴定出合适的醛还原酶基因。大肠杆菌转化体中ARO10和YAHK的共表达在批处理培养中产生1.1 g/L的2-苯基乙醇。我们假设PDC活动可能有瓶颈。利用基于计算机的酶进化来增强产量。与野生型ARO10相比，在ARO10（ARO10 I544W）中引入氨基酸取代（ARO10 I544W）稳定了苯基丙酮酸底物的芳族环，增加了2-苯基乙醇的产量4.1倍。培养ARO10 I544W表达大肠杆菌的培养2.5 g/l的2-苯基乙醇，在72小时后，葡萄糖的产量为0.16 g/g。这种方法代表着显着的进步，迄今为止使用微生物从葡萄糖中获得了2-苯基乙醇的最高收率。培养ARO10 I544W表达大肠杆菌的培养2.5 g/l的2-苯基乙醇，在72小时后，葡萄糖的产量为0.16 g/g。这种方法代表着显着的进步，迄今为止使用微生物从葡萄糖中获得了2-苯基乙醇的最高收率。
使用BT Cry2a基因和印度品种Arka Vikas 的遗传转化使用BT Cry2a基因和印度品种Arka Vikas
南印度品种Arka Vikas的转基因番茄植物是使用农杆菌菌株EHA 105开发的，该菌株具有bt Cry2a基因，其中包含35S CAMV启动子，OCS终止剂和NPTII -NEPTI -NEPTI -NOPTII -abledable Marker，通过Agrobacterium Medimed -MediDied Transformation。进行了这项研究是为了改善南印度品种Arka Vikas的再生和转化方案。下胚基被用作由于较高的再生效率，通过PCR分子分析t 0生成中的推定转化体，用于t 0生成中的分子分析，并进行了定性ELISA方法，以用于BT蛋白表达，然后进行昆虫生物测定。昆虫生物测定研究，以筛选植物，并在后代进一步携带了用分子和表型特征表达良好耐药性的植物。实验结果得出的结论是，BT基因成功地部署在番茄品种中，并在实验室条件下对Helicoverpa Armigera的新生儿幼虫产生了抗性。这些结果表明转基因线在Helicoverpa Armigera的管理中有效地表达了大量的BT Cry2a蛋白。转基因T 1系的精确筛选对于获得单拷贝数植物非常重要，因为连续一代中BT蛋白的表达促进了将来该害虫的有效管理。
利用 CRISPR/Cas9 对森林病原菌 Dothistroma septosporum 进行靶向基因突变
摘要：由松针落针病菌引起的松针落针病在过去几十年中发病率和严重程度不断增加，目前已成为全球最重要的松树疾病之一。了解病原体毒力因子及其宿主靶标可以加速抗病育种。然而，由于松针落针病菌中靶向基因破坏效率低下，阻碍了这一进程，而靶向基因破坏是毒力基因表征所必需的。本文我们首次成功将 CRISPR/Cas9 基因编辑应用于松针落针病菌。使用非同源末端连接修复破坏了具有已知表型的松针落针通路调节基因 AflR，效率超过 90%。产生了具有一系列 AflR 破坏突变的转化子。通过使用特定的供体 DNA 修复模板来帮助选择未知表型的 Ds74283，我们还利用 CRISPR/Cas9 破坏了 Ds74283（一种编码分泌细胞死亡诱导物的 D. septosporum 基因）。在这种情况下，100% 的筛选转化体被鉴定为破坏体。在将 CRISPR/Cas9 确立为 D. septosporum 基因编辑工具的过程中，我们的研究可以快速追踪 D. septosporum 中候选毒力因子的功能表征，并为在其他森林病原体中开发该技术奠定基础。
一种用于检测蛋白质的酵母交配选择方案
最近，出现了一种新的蛋白质蛋白质相互作用研究的方法。可以使用田野和同事开发的“两杂交系统”（1，2）来寻找新的相互作用蛋白质，或者验证和表征可能会根据遗传或生物化学数据关联的蛋白质之间的相互作用。两种杂交系统是一种分子遗传方法，它利用酵母转录因子GAL4的结构柔韧性。GAL4蛋白包含两个结构域，即DNA结合域和转录激活剂结构域。这两个结构域不必成为同一蛋白的一部分来完成转录激活（3）。当两个结构域分别融合到两个无关但相互作用的蛋白质时，由于蛋白质 - 蛋白质相互作用，可以实现转录激活。通常，使用两种杂交系统对新的相互作用蛋白进行搜索是通过将含有UASC的集成拷贝的酵母菌菌株共转换。1J-LACZ报告基因和两个质粒（2，4-6）。一个质粒编码GAL4的DNA结合结构域与感兴趣的蛋白质的融合，而另一个质粒（库质粒）编码GAL4转录激活结构域的融合以随机生成的编码区域。因此，DNA结合结构域融合将与报告基因上游的UASGAL元件结合。如果由文库融合质粒编码的蛋白质与感兴趣的蛋白质相互作用，则转录激活结构域成为报告基因上游的共定位，从而导致转录激活。有效使用两个杂交系统需要产生大量的酵母转化体。由于酵母的转化仍然比细菌的效率低四个数量级，因此对于详尽的cDNA文库筛网来说，转化可能是限制步骤。在本文中，我们设计了一种简单的方法，可以消除对转化的需求，并允许用户搜索
加速叶绿体工程
摘要：创建转基因微生物的“无标记”策略避免了潜在的抗生素抗性基因向其他微生物传播的问题。已经建立的策略，用于设计绿色Microalga衣原体的叶绿体基因组（= plastome）Reinhardtii，涉及使用在钥匙光合作用基因中携带质体突变的受体菌株恢复光合作用功能。在最小培养基上进行转化菌落的选择，使得只有在转基因DNA上进行的野生型拷贝代替突变基因的细胞才能具有光营养的生长。然而，由于使用有限的光敏性表型的突变株，这种方法可能会遭受效率问题，而在最小培养基上的生长缓慢以及未转换的细胞草坪的缓慢倒退。此外，这种光营养的救援往往依靠现有的突变体，这些突变体不一定是转化和靶向转基因插入的理想的：携带点突变的突变体可以轻易恢复，而那些没有删除的突变体不扩展到预期的转基因插入部位，这会引起缺乏过境的救援线的群体，从而引起了缺乏过境的线索。为了改善和加速C. renhardtii的转换管道，我们创建了一个新颖的受体线Hnt6，该系列在PSAA的外显子3中携带了工程删除，该删除编码了光学系统I（PSI）的核心亚基之一。我们使用荧光素酶报道器演示了HNT6的应用。这种PSI突变体是高度光敏的，可以通过在含乙酸乙酸酯的培养基上选择轻耐性，而不是在最小培养基上的光营养生长来更快地恢复转化菌落。缺失延伸到PSAA-3上游的位点，该位点是用于转基因插入的中性基因座，从而确保所有回收的菌落都是包含转基因的转化体。
如何使用基因组编辑工具生成等位基因系列
基因组编辑工具极大地促进了通过靶向诱变对目标基因进行功能分析。现在有许多可用的基因组编辑工具，包括不同的位点特异性核酸酶和允许在给定位点引入单核苷酸多态性 (SNP) 的编辑器数据库。这些工具可用于在给定基因座产生高等位基因多样性，以促进基因功能研究，包括检查特定蛋白质结构域或单个氨基酸的作用。我们比较了我们的 LbCPF1、SpCAS9 和碱基编辑器 (BECAS9) 构建体对 OsCAO1 基因产生的效果、效率和突变类型。SpCAS9 和 LbCPF1 在产生突变方面具有相似的效率，但在诱导的突变类型上有所不同，对于 SpCAS9 和 LbCPF1，大多数变化分别是单核苷酸插入和短缺失。杂合子的比例也不同，在我们的 LbCPF1 中占大多数，而使用 SpCAS9，我们获得了大量双等位基因突变体。最后，我们证明了使用 BECAS9 可以特异性地引入终止密码子，可接受的效率约为 20%。基于这些结果，可以根据希望引入的突变类型在这三种替代方案中进行合理的选择，这三种系统是互补的。SpCAS9 仍然是在初级转化体中产生 KO 突变的最佳选择，而如果所需的基因突变干扰再生或生存能力，则将优先使用我们的 LbCPF1 构造，因为它主要产生杂合子。其他研究已将 LbCPF1 描述为在产生纯合和双等位基因突变方面与 SpCAS9 一样有效。未来仍有待澄清，不同的 LbCFP1 构造是否具有不同的效率并确定这些差异的来源。最后，如果希望专门引入终止密码子，BECAS9 是一种可行且有效的替代方案，尽管它在创建 KO 突变方面的效率低于 SpCAS9 和 LbCPF1。
J. A MER . S OC . H ORT . S CI . 148(6):266 – 275. 2023. https://doi.org/10.21273/JASHS05311-23 CRISPR/Cas9 介导的菊粉双靶向诱变
摘要 。橡胶蒲公英 ( Taraxacum kok-saghyz ) 是一种天然产橡胶的蒲公英，具有成为工业作物的潜力。菊粉是橡胶蒲公英中的储存碳水化合物，其合成与橡胶生产竞争同化碳。我们使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 系统同时靶向编码 1-果聚糖的基因中的两个位点：果聚糖-1-果糖基转移酶基因 (1-FFT)，这是菊粉生物合成中的关键酶。使用发根农杆菌和根癌农杆菌介导的植物转化方法产生具有 CRISPR/Cas9 元件的转基因植物。通过 A 的转化率分别为 71% 和 64%。 rhizogenes 和 A. tumefaciens 介导的转化分别对转基因橡胶蒲公英和根癌农杆菌介导的转化进行了研究。通过限制性位点丢失法和桑格测序证实了诱变。在通过 A. rhizogenes 获得的 13 株转基因植物中，有 6 株显示 1-FFT 基因内的两个靶位点均进行了编辑。使用 A. rhizogenes 介导的转化在 10 周内获得了转基因橡胶蒲公英植物，这比 A. tumafaciens 转化子所需的 6 个月要快得多。在通过 A. tumefaciens 获得的 11 株转基因植物中，有 5 株在两个靶位点都发生了突变。逆转录聚合酶链式反应证实了所有编辑转化子中 Cas9 的表达。A. rhizogenes 介导的双突变转化子和 A. tumefaciens 介导的双突变转化子的菊粉含量都低于野生型植物。此外，A. rhizogenes 介导的转化体的橡胶含量高于野生型植物。因此，本研究验证了使用 CRISPR/Cas9 基因编辑作为橡胶蒲公英中产生有用突变的有效工具，并且可以在未来的作物改良方法中实施。