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招募内源性和外源性ADAR酶进行位点特异性RNA编辑的方法
作用于 RNA 的腺苷脱氨酶 (ADAR) 可以重新用于实现位点特异性的 A-to-I RNA 编辑，方法是通过 ADAR 招募向导 RNA (adRNA) 将它们招募到感兴趣的靶标上。在本章中，我们详细介绍了通过两种正交策略实现此目的的实验方法：一是通过招募内源性 ADAR（即已经在细胞中天然表达的 ADAR）；二是通过招募外源性 ADAR（即将 ADAR 递送到细胞中）。对于前者，我们描述了使用环状 adRNA 将内源性 ADAR 招募到所需的 mRNA 靶标上。这可在体外和体内实现稳健、持久且高度转录特异性的编辑。对于后者，我们描述了使用 split-ADAR2 系统，该系统允许过度表达 ADAR2 变体，可用于以高特异性编辑腺苷，包括难以编辑非优选基序中的腺苷，例如 5′ 鸟苷两侧的腺苷。我们预计所述方法应促进研究和生物技术环境中的 RNA 编辑应用。
通过 CRISPR RNA 支架同时进行多功能转录组工程。
RNA 加工和代谢在细胞内受到精确调控，以确保 RNA 的完整性和功能。尽管随着 CRISPR-Cas13 系统的发现和改造，靶向 RNA 工程已成为可能，但同时调节不同的 RNA 加工步骤仍然无法实现。此外，与 dCas13 融合的效应物导致的脱靶事件限制了其应用。在这里，我们开发了一个新平台，通过 S 支架标记的 gRNA 进行组合 RNA 工程 (CREST)，它可以同时对不同的 RNA 靶标执行多种 RNA 调节功能。在 CREST 中，RNA 支架附加到 Cas13 gRNA 的 3' 端，其同源 RNA 结合蛋白与酶结构域融合以进行操作。以 RNA 可变剪接、A 到 G 和 C 到 U 碱基编辑为例，我们开发了双功能和三功能 CREST 系统，用于同时进行 RNA 操作。此外，通过将 ADAR2 脱氨酶结构域的两个分裂片段分别与 dCas13 和/或 PUFc 融合，我们重建了其在靶位点的酶活性。这种分裂设计可以减少近 99% 的脱靶事件，而这些事件通常是由全长效应物引起的。CREST 框架的灵活性将丰富用于研究 RNA 生物学的转录组工程工具箱。
血清素 2C 受体的 RNA 编辑与酒精摄入
血清素 2C 受体 (5-HT 2C R) 属于与 G 蛋白偶联的七个跨膜结构域受体 (GPCR) 超家族。它广泛分布于中枢神经系统，在边缘系统中表达相对较高，包括杏仁核、伏隔核 (NAc)、海马和下丘脑。根据其表达模式和大量药理学研究，5-HT 2C R 被认为参与各种大脑功能，包括情绪、食欲和运动行为。在这里，我们回顾了 5-HT 2C R 及其与酒精摄入的关系，特别关注 5-HT 2C R mRNA 编辑的参与及其与小鼠酒精偏好的关系。RNA 编辑是一种转录后修饰机制。在哺乳动物中，腺苷通过脱氨酶 ADAR1 和 ADAR2 转化为肌苷。5-HT 2C R 是唯一在编码区内进行 RNA 编辑的 GPCR。它在外显子 5 中有五个编辑位点，编码第二个细胞内环。因此，未编辑受体 (INI) 的三个氨基酸残基 (I156、N158 和 I160) 可能会改变为不同的编辑异构体，从而导致受体活性（如 5-HT 效力和 G 蛋白偶联）发生变化。NAc 中的 5-HT 2C R 与长期酒精暴露后的饮酒增强有关，5-HT 2C R mRNA 编辑的改变对于使用不同品系的小鼠和转基因小鼠确定酒精偏好非常重要。该受体的 RNA 编辑可能参与酒精中毒的发展。
Squid Express保守的ADAR直系同源物，具有新的特征
小球形头足动物通过腺苷脱氨基表现出异常广泛的mRNA，但尚不清楚基本机制。由于作用于RNA（ADAR）酶的腺苷脱氨酶会催化这种形式的RNA编辑，因此头足类直系同源物的结构和功能可能会提供线索。最近的基因组测序项目提供了蓝图，以全面互补。我们实验室的先前结果表明，Squid表达了一个ADAR2同源物，具有两个名为SQADAR2A和SQADAR2B的剪接变体，并且这些消息经过广泛编辑。基于章鱼和鱿鱼基因组，转录组和cDNA克隆，我们发现在小卵形中表达了另外两个ADAR同源物。第一个与脊椎动物ADAR1直系同源。与其他ADAR1不同，它包含一个新型的N末端结构域，为641 AA，预测为无序，包含67个磷酸化基序，并且具有氨基酸组成，丝氨酸和碱性氨基酸的氨基酸组成异常高。编码sqadar1的mRNA本身是广泛编辑的。也存在于任何脊椎动物同工型的直系同源的sqadar/d-like酶。编码SQADAR/D类的消息未编辑。使用重组SQADAR的研究表明，仅在完美的双链dsRNA和鱿鱼钾通道mRNA底物上，只有SQADAR1和SQADAR2是活跃的腺苷脱氨酶。sqadar/d样对这些底物没有活性。对这些底物没有活性。总体而言，这些结果揭示了SQADARS中的一些独特特征，这些特征可能会导致头足类动物中观察到的高级RNA回收。
标题对单细胞分辨率的RNA编辑调查将中间神经元与精神分裂症和自闭症联系起来Brendan Robert E. Ansell 1 2，Simon N. Thomas
澳大利亚2。澳大利亚维多利亚州帕克维尔市墨尔本大学医学生物学系3. 分子医学部，哈里·珀金斯医学研究所，西澳大利亚州默多克，澳大利亚摘要背景：通过Adar酶将腺苷转化为RNA中的inosine insine insine酶，发生在人类转录组中的数千个地点，对于健康的大脑发育至关重要。 在许多神经精神疾病中，这种编辑过程失调，但尚未按单个神经元的水平进行大规模研究。 方法：我们在全长捕获核转录组中量化了RNA编辑位点，该位点的核转录组是来自六个神经型验尸后女性供体的六个皮质区域的3055个神经元的核转录组。 推定的编辑位点与包括健康和神经精神脑组织在内的散装人体组织转录组中的位点相交，并在无关脑供体的单个核中鉴定出的位点。 使用线性模型对细胞类型和皮质区域以及其中的各个位点和基因之间的差异编辑。 还测试了基因丰度与编辑之间的。 结果：我们在至少十个神经元核中鉴定了41,930个RNA编辑位点，具有可靠的读取覆盖率。 大多数站点位于内含子或3'UTR中的Alu重复序列中，并且在已发表的RNA编辑数据库中分类了约80％。 我们确定了9285个假定的新型RNA编辑位点，其中29％在无关供体的神经元转录组中也可检测到。 自闭症相关的基因富含预测可修饰RNA结构的编辑位点。澳大利亚维多利亚州帕克维尔市墨尔本大学医学生物学系3.分子医学部，哈里·珀金斯医学研究所，西澳大利亚州默多克，澳大利亚摘要背景：通过Adar酶将腺苷转化为RNA中的inosine insine insine酶，发生在人类转录组中的数千个地点，对于健康的大脑发育至关重要。在许多神经精神疾病中，这种编辑过程失调，但尚未按单个神经元的水平进行大规模研究。方法：我们在全长捕获核转录组中量化了RNA编辑位点，该位点的核转录组是来自六个神经型验尸后女性供体的六个皮质区域的3055个神经元的核转录组。推定的编辑位点与包括健康和神经精神脑组织在内的散装人体组织转录组中的位点相交，并在无关脑供体的单个核中鉴定出的位点。使用线性模型对细胞类型和皮质区域以及其中的各个位点和基因之间的差异编辑。。结果：我们在至少十个神经元核中鉴定了41,930个RNA编辑位点，具有可靠的读取覆盖率。大多数站点位于内含子或3'UTR中的Alu重复序列中，并且在已发表的RNA编辑数据库中分类了约80％。我们确定了9285个假定的新型RNA编辑位点，其中29％在无关供体的神经元转录组中也可检测到。自闭症相关的基因富含预测可修饰RNA结构的编辑位点。全球编辑率最强的相关性是SNORD115和SNORD116群集（15Q11）的snornas，该snornas已知可调节5-羟色胺受体加工并与ADAR2共定位。抑制性神经元比兴奋性神经元更高的总体转录组编辑。 此外，我们确定了在兴奋性神经元中优先编辑的29个基因和43个基因在包括RBFOX1，其靶基因的抑制性神经元中更严重，在自闭症相关的Prader-willi locus-Willi locus 15q11中，包括RBFOX1，其靶基因和小核仁RNA相关基因。 这些结果为1730个地点提供了细胞类型和空间上下文，这些位点在精神分裂症患者的大脑中差异化，自闭症患者中有910个部位。 结论：RNA编辑，包括数千个先前未报告的位点，在单个神经元核中可牢固地检测到，其中细胞亚型之间的基因编辑差异比皮质区域之间的差异更强。 抑制性神经元中自闭症相关基因的编辑不足可能在自闭症中这些细胞的特异性扰动中表现出来。抑制性神经元比兴奋性神经元更高的总体转录组编辑。此外，我们确定了在兴奋性神经元中优先编辑的29个基因和43个基因在包括RBFOX1，其靶基因的抑制性神经元中更严重，在自闭症相关的Prader-willi locus-Willi locus 15q11中，包括RBFOX1，其靶基因和小核仁RNA相关基因。这些结果为1730个地点提供了细胞类型和空间上下文，这些位点在精神分裂症患者的大脑中差异化，自闭症患者中有910个部位。结论：RNA编辑，包括数千个先前未报告的位点，在单个神经元核中可牢固地检测到，其中细胞亚型之间的基因编辑差异比皮质区域之间的差异更强。抑制性神经元中自闭症相关基因的编辑不足可能在自闭症中这些细胞的特异性扰动中表现出来。抑制性神经元中自闭症相关基因的编辑不足可能在自闭症中这些细胞的特异性扰动中表现出来。