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addgene＃52961（puro）https：// www
crispr介导的基因激活A La Feng Zhang等人，自然协议（2017），PMID：28333914“基因组cris crisr-carspr-cas9敲除和转录激活筛选” （＃1587，https：//www.addgene.org/89308） 制作lenti病毒，请参阅其他地方，使用矢量1和向量2对靶细胞进行选择，选择带有HYG和BSD的细胞，而Lenti-MPH V2表达细胞系可以首先建立。 所有一个向量都可以使用＃167934 https://www.addgene.org/167934/制作lenti病毒，请参阅其他地方，使用矢量1和向量2对靶细胞进行选择，选择带有HYG和BSD的细胞，而Lenti-MPH V2表达细胞系可以首先建立。所有一个向量都可以使用＃167934 https://www.addgene.org/167934/
Addgene's CRISPR 101电子书，第三版
2。在有指导RNA的情况下与靶DNA结合，只要目标是原始的邻接基序的上游（5'），GRNA和cas9核酸内切酶都会形成Cas9：GRNA复合物。cas9核酸内切酶与靶基因组基因核基因座结合均由导向RNA中包含的靶序列介导，又介导了一个3碱基对序列，称为原始序列相邻基序或PAM。为了通过CAS9切割DsDNA，它必须立即包含由导向RNA靶向的位点下游（3'）的PAM序列。在没有引导RNA或PAM序列的情况下，CAS9既不会结合也不会切割目标。Cas9同源物（请参见下表）具有不同的PAM要求。这些不同的PAM要求使研究人员能够针对许多不同的基因组基因座。
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基于存储库的质粒设计
过去十年，序列库中可商用 DNA 的数量呈爆炸式增长。在三大最大的 DNA 库：iGEM、Addgene 和 DNASU 中，此类质粒的数量从 12,000 个增加到 300,000 多个。生物设计中的一个挑战仍然是如何有效、正确和无缝地使用这些和其他基于库的序列。这项工作描述了一种质粒设计方法，其中质粒被指定为简单的 DNA 序列或特征列表。然后，所提出的软件通过 Gibson assembly ® 找到最具成本效益的合成和 PCR 制备的库片段组合来构建质粒。它在用户指定和公共 DNA 数据库中查找现有的 DNA 序列：iGEM、Addgene 和 DNASU。引入并针对 2005 年之后的所有 iGEM 复合部件和 2018 年提交的所有 Addgene 载体进行了此类软件应用程序的描述，结果发现与纯合成质粒设计方法相比，成本降低了 34%。所述软件将通过缩短设计时间、提高构建质量和降低成本来改进当前的质粒组装工作流程。
果糖与葡萄糖：调节干细胞生长和通过补充糖的功能
试剂或资源源标识符化学品，肽和重组蛋白Puelink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A ISCRIPT™ISCRIPT™cDNA合成Kit Kit Biorad 1708840 Sybr™SELICS SYBR™SELECT MASTER MASTER MASTER MIST 4-12％，10井Genscript M00653胶原酶II Sigma C2-28-100MG DMEM（无葡萄糖）GIBCO GIBCO 11-966-025 FBS FISHER FISHER FISHER SCOCICILIFIC SH3010903 PENICILLIN SH30103 PhosSTOP Roche 4906845001 IBMX Sigma 410957 Insulin Sigma I5500 Indomethacin Sigma 405268 Triiodothyronine (T3) Sigma T6397 Dexamethasone Sigma 265005 Rosiglitazone Sigma PHR2932 LipidTOX deep red neutral lipid stain Fisher Scientific H34477超级阻止诱因37535抗体抗KHK Sigma HPA007040抗HIF1α（D2U3T）细胞信号传导14179抗PPARγ（C26H12）细胞信号2443 C/EBPα细胞信号8178 Anti-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-aint-EBPα细胞信号8178 Anti-al timnigin-αtubin tim-αtubin（38）细胞信号2250质粒和siRNA PVSV-G添加剂138479 PCL-ECO ADDGENE 12371 PBABE-NEOLARGE TCDNA ADDGENE 1780人HIF1A 3091 sirna accell drm-a-a-a-a-004018230001生物。n/a
用于生成trichoderma koningiopsis的原生质体和质粒DNA
转换方案可以在一天之内进行PEG介导的转换和ATMT，而对于电穿孔和LiPofection，这两者都可以在半天内完成。但是，材料和设备设置部分中列出的缓冲区和材料的早期准备是必不可少的。要准备培养物，必须根据所选技术在3到5天之间生长真菌。菌丝体可以在3天后在液体培养中产生，但是对于孢子，必须在固体培养基上生长4-5天。转化后，必须将真菌种植2周，在此期间需要3个亚文化才能获得均应转化剂。全部，转换的时间表在3到4周之间。使用质粒PDHT/SK-CEP进行所有实验，为此，骨架是从Zhihua Zhou（addgene质粒＃92126）获得的。7
一组用于利用野生型菌株多样性的解脂耶氏酵母 CRISPR/Cas9 载体
摘要 目的 构建和验证一组含有六种不同标记的解脂耶氏酵母 CRISPR/Cas9 载体，可编辑几乎任何遗传背景，包括野生型菌株的遗传背景。 结果 使用 Golden Gate 方法，我们组装了一组六个 CRISPR/Cas9 载体，每个载体含有不同的选择标记，用于编辑工业酵母解脂耶氏酵母的基因组。此载体组可通过 Addgene 获得。使用 Golden Gate 组装，可以轻松快速地将任何向导 RNA (gRNA) 序列引入这些载体中的任何一个。使用这六个载体中的五种，我们成功地编辑了各种遗传背景（包括野生型菌株）中的六种不同基因。使用这些载体大大改善了特定位点的同源重组和盒式整合。结论我们已经创建了一套多功能、模块化的 CRISPR/Cas9 载体，可以快速编辑任何解脂耶氏酵母菌株；该工具将
目标活动预测可以改进 CRISPR-...
利用 Cas9 的催化失活突变体（称为 dCas9）阻断细菌基因表达的能力正迅速成为一种标准方法，用于探测基因功能、进行高通量筛选和设计细胞以达到预期目的。然而，我们仍然缺乏对决定 dCas9 靶向活性的设计规则的良好理解。利用高通量筛选数据，我们建立了一个模型，根据靶序列预测 dCas9 阻断 RNA 聚合酶的能力，并在独立生成的数据集上验证其性能。我们进一步为大肠杆菌 MG1655 EcoWG1 设计了一个新型的全基因组向导 RNA 文库，使用我们的模型选择具有高活性的向导，同时避免可能有毒或具有脱靶效应的向导。在富集培养基中生长期间使用 EcoWG1 库进行的筛选比之前发布的筛选有所改进，表明仅使用少量精心设计的指南即可获得非常好的性能。能够设计有效的小型库将有助于使 CRISPRi 筛选更容易执行且更具成本效益。我们的模型和材料可通过 crispr.pasteur.fr 和 Addgene 向社区提供。
目标活动预测可以改进 CRISPR–...
利用 Cas9 的催化失活突变体（称为 dCas9）阻断细菌基因表达的能力正迅速成为一种标准方法，用于探测基因功能、进行高通量筛选和设计细胞以达到预期目的。然而，我们仍然缺乏对决定 dCas9 靶向活性的设计规则的良好理解。利用高通量筛选数据，我们建立了一个模型，根据靶序列预测 dCas9 阻断 RNA 聚合酶的能力，并在独立生成的数据集上验证其性能。我们进一步为大肠杆菌 MG1655 EcoWG1 设计了一个新型的全基因组向导 RNA 文库，使用我们的模型选择具有高活性的向导，同时避免可能有毒或具有脱靶效应的向导。在富集培养基中生长期间使用 EcoWG1 库进行的筛选比之前发布的筛选有所改进，表明仅使用少量精心设计的指南即可获得非常好的性能。能够设计有效的小型库将有助于使 CRISPRi 筛选更容易执行且更具成本效益。我们的模型和材料可通过 crispr.pasteur.fr 和 Addgene 向社区提供。
无需双链 DNA 切割即可在人类类器官中进行高效、无误的荧光基因标记
CRISPR 相关核酸酶是精确编辑模型系统（包括人类类器官）基因组的有力工具。目前描述类器官中荧光基因标记的方法依赖于 DNA 双链断裂 (DSB) 的产生，以刺激同源定向修复 (HDR) 或非同源末端连接 (NHEJ) 介导的所需敲入整合。DSB 介导的基因组编辑的一个主要缺点是需要克隆选择和扩增候选类器官以验证目标基因座的基因组完整性并确认没有脱靶插入/缺失。相比之下，基因组位点和靶向载体的同时切口，称为反式配对切口 (ITPN)，可刺激有效的 HDR 介导的基因组编辑以产生大量敲入而不会引入 DSB。在这里，我们表明 ITPN 可以在人类正常和癌症类器官中实现快速、高效且无插入/缺失的荧光基因标记。为了突出 ITPN 的简便性和效率，我们生成了三重荧光敲入类器官，其中 3 个基因组位点在单轮靶向中同时被修改。此外，我们通过一步差异化修改母系和父系等位基因，生成了具有等位基因特异性读数的模型系统。ITPN 使用我们的靶向载体调色板（可从 Addgene 公开获得），非常适合在人类类器官中生成无错误的杂合敲入。