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限制摘要和琼脂糖凝胶电泳
T ECHNIQUES I N M OLECULAR B IOLOGY – R ESTRICTION D IGEST AND A GAROSE G EL E LECTROPHORESIS This lab will introduce you to DNA modification by restriction enzymes using the purified plasmids you prepared from your transformation.我们还将使用水平凝胶电泳对纯化的质粒和消化进行分析。您将对限制酶进行切割之前和之后对纯化的质粒进行凝胶分析。您将执行质粒的模拟（控制）摘要，一种具有两种不同限制酶和双重摘要的单个摘要。从中，您应该能够确定Qiagen微型制备质粒DNA的纯度，以及在PQE60载体中的WGMDH插入物。一定要阅读有关限制摘要（教科书读数）和琼脂糖凝胶（教科书和讲义）的信息，以了解每个概念的理论，并了解执行成功实验所需的细节。必需的视频 - 新英格兰Biolabs准备的网页上的限制酶链接。观看所需的最小视频是（具有限制性酶的消化，限制酶消化的标准协议和NEB限制酶Double Digigest协议视频）。在进行实验之前，您还应该查看其他几个。https://www.neb.com/applications/cloning-‐and-‐synthetic-‐ biology/dna-‐preparation/restriction-‐enzyme-‐digestion Practical notes on Restriction Endonucleases (RE) and Their Use Enzymatic Unit definition: 1 Unit = amount of enzyme necessary to digest 1 µg DNA in 1 hr (37°C, with适当的缓冲区）。glycerol Re Digests。确保您使用的是正确的缓冲液，酶与底物的正确比率（DNA和正确消化的条件）。Rextion缓冲每个限制酶具有一个缓冲液，其中最高活性（通常为10倍浓缩物）。某些酶具有共同的缓冲液，而其他酶则需要与独特的缓冲液一起使用以进行最佳活动。几家公司（以新英格兰的Biolabs为例）具有与多种酶合作的共同缓冲液。您的网站上有一个链接 - 探索几家公司以了解缓冲液和酶。存储条件RE通过反复暴露于较高的温度来对活动丧失敏感；使用库存以长期存储保持在-20°C，在使用时在〜0°C（在冰上）处于〜0°C（在冰上）。进行消化时，温育几个小时后，某些酶的活性就会损失。由于RE昂贵，因此必须谨慎处理库存。酶应在-20°C时不断存储在非冻结冰箱中。（无霜的冰柜定期在冰点上加热以限制冰的积累。）也最好将酶放在冰箱中的绝缘容器中，该酶在打开冰柜时会限制温度变化（如果存储在霜冻的冰柜中，这一点尤其重要）。为防止在-20°C下冻结，RE库存在含有50％甘油的溶液中。由于在存在> 5％甘油的情况下可以抑制或改变RE活性，因此应库存不超过10％的最终RE消化反应混合物。[A 1:10 RE的稀释度将50％的甘油含量为5％。]在不正确的缓冲液条件下或在存在> 5％甘油的情况下，RE的恒星（*）活性可以显示出改变的DNA裂解特异性，称为“恒星活性”。在这种情况下，酶可以识别出其正常6 bp识别位点的4个基对子集，因此将在比预期的更多位点上切割DNA。例如，熟悉的酶EcoRI因其在低离子强度溶液中的恒星活性而臭名昭著。
宾夕法尼亚大学董事会会议...
会议记录宾夕法尼亚大学受托人执行委员会的虚拟会议于2024年7月31日上午11:02通过Zoom举行。Trustees participating : Bonnie Miao Bandeen, Michael L. Barrett, David S. Blitzer, James G. Dinan, Osagie O. Imasogie, J. Larry Jameson, Marc F. McMorris, Dhananjay M. Pai, Julie Beren Platt, Ramanan Raghavendran, Alan D. Schnitzer Administrators and other guests participating : Antony Appleyard, Holly Auer, Neema Baddam, Sarah Banet-Weiser, Jackson Betz, Laura Brennan, Pierce Buller, Craig R. Carnaroli, Michael Citro, Mary Correll, Russell Di Leo, Mark Dingfield, Lee J. Dobkin, Jonathan Epstein, Dmitriy Fedorenko, Alisha George, Fran Grady, Richard Herendeen, Scott Hoeflich, John L. Jackson, Jr., Brianne Jeffrey, Antoine Jones, Michelle Lai, Trevor C. Lewis, Stephen J. MacCarthy, Kevin Mahoney, Chris Masotti, Alison McGhie, Medha Narvekar, Laura Nickrosz, Laura Perna, Lizann Boyle Rode, Alexander Romango, Paul Rothenberger, Michael Scales, Tom Sontag, John Swartley，Corey Wallace，Denene Wambach，Beth A. Winkelstein，Kevin Zhu，Seth Zweifler在会议期间通过的决议的完整文本已附加到本文件中，并被视为这次会议正式记录的一部分。主席报告主席拉马南·拉格文德兰（Ramanan Raghavendran）致电会议命令并欢迎与会者。Raghavendran先生说，会议的目的是考虑一项关于批准资产转让和知识产权转让给富兰克林Biolabs和Gemma Biothapeutics的决议，并补充说，决议的全文可以在会议材料中找到。他说，宾夕法尼亚医学委员会执行委员会已审查并批准了此行动，现在需要受托人的批准。他将会议移交给了临时总统拉里·詹姆森（Larry Jameson），以介绍这一行动。Jameson博士感谢Raghavendran先生，并介绍了宾夕法尼亚大学卫生系统临时执行副校长Jonathan A. Epstein，并介绍了Perelman医学院的临时院长，以总结解决方案。爱泼斯坦博士很高兴为董事会提供有关Penn Medicine的基因疗法计划的令人兴奋的新篇章的信息，称为GTP。他报告说，在吉姆·威尔逊教授的领导下，在过去的几十年中，GTP推动了基因治疗领域的重大进步，通过发现和发展基因 -
telisotuzumab vedotin在C-MET阳性期IV或复发性鳞状细胞肺癌（肺Map子研究S1400K，NCT03574753）
通讯作者：Saiama N. Waqar，MBBS，MSCI，医学副教授，血液学和肿瘤学奖学金计划，华盛顿大学医学院肿瘤学系，660 S Euclid Ave，Campus Box 8056，SAINT LOUIS，MO 63110，电话：（314）747-847-847-77-847-77-84，FAX：（363110） saiamawaqar@wustl.edu。利息冲突Waqar博士报告了这项提交的工作以外的1个UM1 CA186704-01的赠款，以及在这项提交的工作之外的Abbvie向华盛顿大学医学院提供的研究支持。Arnold博士在提交的工作之外报告了Abbvie的其他临床试验的赠款。Hirsch博士已从科罗拉多大学（通过科罗拉多大学通过），实验室支持（通过科罗拉多大学）获得了Abbvie的实验室研究赠款，来自默克大学，Biodesix，Amgen，Amgen，Rain Therapeutics和Mersana，并参加了Abbvie，BMS，Merck，Merck，Genentech，Genentec，Lilly，Lilly，Lilly，Novilly，Novilly，Novilly，Novilly，Novilly，Novilly，Novilly，Novilly，Novillaus。Mack博士报告了Astrazeneca和Amgen的个人费用。Schwartz博士曾担任DSMB成员，旨在对默克，Boehringer Ingelheim，Hoffman La Roche和Novartis的治疗和结果视而不见的响应评估成像研究独立审查。Gandara博士曾在这项提交的工作之外曾在Abbvie顾问委员会任职。Ramalingam博士向Abbvie，Amgen，BMS，Genentech，Lilly，Takeda和Loxo报告了顾问委员会的个人费用，并从Astrazeneca，Merck和Tesaro的赠款以及提交的工作之外的赠款。Dr. Kelly reports research grants and personal fees for Advisory Board from AbbVie outside this submitted work, personal fees from AstraZeneca for participation in Advisory Board and DMC meeting, research grant (drug only) and personal fees for Advisory Board from Bristol Meyers Squibb, research funding (drug only) and personal fees for DMC meeting from Genentech, personal fees for Advisory Board from Pfizer outside the submitted work.Herbst博士报告了Abbvie Pharmaceuticals，Armo Biosciences，Biodesix，Bristol-Myers Squibb，Emd Serrano，Genmab，Halozyme，Halozyme，Heazyme，Loxo Oncologics，Loxo肿瘤学，Nektar，Nektar，Nektar，Nokartis，Pfizer，Pfizer，Sanofi，Shanofi，Shanfie symeg tocrum plecrum plecrum plec， Tesaro，Imab Biopharma，Immunocore，Midas Health Analytics，Mirati Tnerapeutics和Takeda；以及阿斯利康（Astrazeneca），默克公司（Merck and Merck and Company），埃利礼来公司（Eli Lilly and Company）的赠款和个人费用，Genentech/Roche；来自Infinity Pharmaceuticals，Neon Therapeutics和Next Cure的科学顾问委员会的个人费用；以及提交工作之外的Junshi Pharmaceuticals的董事会会员资格（非执行/独立）的个人费用。Dr Papadimitrakopoulou is currently an employee of Pfizer, Inc. and has received personal fees for Advisory Board from Abbvie, and personal fees from Eli Lilly, Novartis, Merck, Nektar Therapeutics, Janssen, Araxes, Arrys Therapeutics, Clovis Oncology, Exelixis, Gritstone, Ideaya, Leeds Biolabs, Loxo Oncology, Takeda，Tesaro，TRM肿瘤学以外提交的作品，以及Eli Lilly，Novartis，Merck，Nektar Therapeutics，Janssen Checkmate和Incyte的赠款。
RNase 4（NEB＃M1284）MRNA 5´CAP结构的DNA探针指导分析| neb nebnext UltraExpress FS DNA库准备套件E3340手册 化学品安全技术说明书 使用Nebridge®金门组件进行蛋白质工程的DNA洗牌 君主质粒小型套件T1010手册 新英格兰Biolabs分析证书 胜任的细胞 基因组编辑 Authenticase M0689手册 R＆D和对... 的制造支持 新英格兰Biolabs分析证书 Authenticase M0689手册 裂解靠近DNA片段的末端（线性化矢量） Nebnext Ultra DNA库Prep套件，用于Illumina E7370手册 腺病毒2 Nebnext Ultra II DNA库Prep套件，用于Illumina，用于Illumina（独特的双索引UMI适配器DNA）E7645 E7645 E7103手动 NEBNEXT微生物组DNA富集试剂盒E2612手册 DNA组装与合成生物学 DNA组装与合成生物学 通过双链DNA片段的单链DNA寡桥构建SGRNA-CAS9表达载体 nebnext®快速DNA库预备组件454 Monarch MAG病毒DNA/RNA提取套件T4010手册 新英格兰Biolabs分析证书 T4 DNA连接酶（M0202）CHN 的安全数据表 翠鸟柔性自动隔离病毒DNA/RNA的方案| neb 基因编辑 φx174
已测试至少20 nt。探针可以用3´或5´生物素/Desthiobiotin亲和力组设计，用于链霉亲和素富集（NEB＃S1421）。为了获得最佳结果，受保护的DNA：RNA杂交区应为4或5个核苷酸
碱基编辑酶 APOBEC3A 以低效率和高选择性催化 RNA 中的胞嘧啶脱氨
A3A 和 eA3A 表达。A3A 表达构建体 (Addgene #109231) 之前已有描述，可用于纯化 A3A 作为融合蛋白 (MBP-A3A-His)，可进一步加工以生成分离的 A3A 结构域。32,33 对于 eA3A (A3A-N57G)，N57G 突变是通过 Q5 定点诱变 (New England Biolabs, NEB) 引入的。A3A 和 eA3A 构建体的细菌表达之前已有详细描述。 33 将纯化的 MBP-A3A-His、MBP-eA3A-His 或分离的 A3A 在 50 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.5 mM DTT 和 0.01% Tween-20 中透析过夜，并使用 BSA 标准曲线确定蛋白质浓度。基于 SwaI 的脱氨酶对 ssDNA 和嵌合底物的活性。5'-荧光素 (FAM) 荧光标记的底物 S35-dC 或具有单个靶核糖胞嘧啶的匹配底物（在其他 DNA 骨架中）（S35-rC）由 Integrated DNA Technologies (IDT) 合成，以及相关产品对照（S35-dU 和 S35-rU）。在最佳 A3A 反应条件（最终为 20 mM 琥珀酸：NaH 2 PO 4：甘氨酸 (SPG) 缓冲液 pH 5.5，0.1% Tween-20）下，用 6 倍稀释的未标记 A3A（从 1 µM 到 4 pM）处理 100 µM 寡核苷酸。反应在 37 ˚C 下进行 30 分钟，然后终止（95 ˚C，10 分钟）。然后加入 200 nM 互补链并退火。加入 SwaI (NEB)，在室温下消化过夜。加入甲酰胺上样缓冲液，样品加热变性（95 ˚C，20 分钟），然后在 50 ˚C 下在 20% 变性 TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶上运行。使用 Typhoon 成像仪（GE Healthcare）上的 FAM 滤光片对凝胶进行成像。使用 ImageJ 中的面积量化工具进行定量分析。720 碱基对 ssDNA 底物的合成。为了生成 ssDNA，使用 720 bp gBlock 基因片段 (IDT) 作为模板 (补充图 2a)，并使用 Taq 聚合酶 (NEB) 进行扩增，采用指数后线性 (LATE) PCR 反应方案，该方案采用相对于磷酸化的反向引物过量的正向引物。32 对反应物进行纯化 (NucleoSpin、Fisher)，然后在 37 ˚C 下用 核酸外切酶处理 1 小时以降解磷酸化链，然后进行热失活 (90 ˚C，10 分钟)。然后将产物在 2% 琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶 DNA 回收试剂盒 (Zymoclean) 回收 ssDNA。通过乙醇沉淀进一步纯化 ssDNA，并使用 Qubit ® 荧光计 (ThermoFisher) 测量其浓度。对于一个重复，ssDNA 以大分子寡核苷酸 (IDT) 的形式获得，并通过乙醇沉淀进一步纯化。720 聚体 RNA 底物的合成。使用 720 bp 基因块 (IDT) dsDNA 作为模板，在推荐条件下使用 TranscriptAid Enzyme Mix (ThermoFisher) 通过体外转录生成 RNA，并在 37 ˚C 下孵育两小时。然后通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀纯化 RNA。将样品重新悬浮在无核酸酶的水中，并进一步用 MspI、XbaI 和 AclI 限制性酶 (NEB) 处理以消化任何剩余的 DNA 模板。在 37 ˚C 下孵育 1 小时后，使用 RNA Clean and Concentrator-5 试剂盒 (Zymo Research) 纯化 RNA。为了进一步确保完全去除模板 DNA，在 37 ˚C 下用 DNase I (Ambion) 处理 RNA 30 分钟。重复纯化 (RNA Clean and Concentrator-5)，并使用 Qubit ® 荧光计测量纯化 RNA 的浓度。通过“预测二级结构网络”预测 720 聚体中几个中尺度区域的二级结构
A.I.对量子安全的影响 Yahoo信息安全 细胞和基因治疗制造2025-小册子和议程 数据领导者的生成ai 的底漆 3D打印时间轴的历史 计算几何 材料科学的人工智能 自定义赠款查找器报告 - 网络示例 自动导向车辆（AGV） 直接空气捕获的永久二氧化碳存储 色带Biolabs呈现在Synbiobeta 2024 产品数据表 - 安全Xchange网络。 Microsoft Azure防火墙的Illumio 爱国者产品Sheet_vp4300 SSD_V23Q3A 算法承保 解决生成AI数据问题 Conagen和Sweegen成功将革命性糖商业化 利用骨肉瘤表面体进行免疫疗法靶标，以阻止转移能力G 第一6：半年威胁报告2024 黎明白皮书2024年7月25日
雅虎公司的伞。确保每个业务部门都符合这些强制性控件为整个Yahoo Enterprise提供了统一的信息安全方法。安全标准和控件由Yahoo Paranoids团队管理，后者是主题专家，并为标准实施提供了中央权威。当每个业务部门以统一的方式实施标准时，整个Yahoo Enterprise更加安全地抵抗复杂的网络安全威胁。控制每个标准中概述的特定的强制安全要求称为控件。每个Yahoo标准中的控件都来自整体Yahoo“统一控制框架”（UCF）中的安全要求库，该库是专门为在颗粒状级别实施安全最佳实践的专门制定的，并与安全标准的NIST分类一致。业务部门有望将每个标准的安全控制视为强制性的，并在Yahoo偏执狂的指导下实施它们。
ISO 45001，供应链和风险深水... 模型条例 - 公用事业规模的电池储能系统 联合国教科文组织科学报告 还原计划 拥抱人工智能 Aker Systems Limited-碳足迹声明和还原计划 在... A.I.对量子安全的影响 Yahoo信息安全 细胞和基因治疗制造2025-小册子和议程 数据领导者的生成ai 的底漆 3D打印时间轴的历史 计算几何 材料科学的人工智能 自定义赠款查找器报告 - 网络示例 自动导向车辆（AGV） 直接空气捕获的永久二氧化碳存储 色带Biolabs呈现在Synbiobeta 2024 产品数据表 - 安全Xchange网络。 Microsoft Azure防火墙的Illumio 爱国者产品Sheet_vp4300 SSD_V23Q3A 算法承保 解决生成AI数据问题 Conagen和Sweegen成功将革命性糖商业化 利用骨肉瘤表面体进行免疫疗法靶标，以阻止转移能力G 第一6：半年威胁报告2024 黎明白皮书2024年7月25日
Cary Usrey是Predictive Solutions Corp.担任此职务，负责为寻求防止工人伤害和减少潜在责任的客户实施培训解决方案和最佳实践。Usrey于1988年开始了他在美国海军的核电计划的职业生涯，然后在阿迪朗达克资源恢复协会担任EHS合规总监已有12年以上。2004年，Usrey担任Turner Construction的职位，在那里他担任纽约州北部办事处的业务部门安全总监。 Usrey目前正在特立尼达州初级学院学习职业安全与健康。 他曾担任VPPPA（第二区）的董事会成员，目前是ASSE的成员。 可以通过cusrey@ preditiveivesolutions.com与他联系。2004年，Usrey担任Turner Construction的职位，在那里他担任纽约州北部办事处的业务部门安全总监。Usrey目前正在特立尼达州初级学院学习职业安全与健康。他曾担任VPPPA（第二区）的董事会成员，目前是ASSE的成员。可以通过cusrey@ preditiveivesolutions.com与他联系。