使用悬垂引物在PCR产物的末端添加悬垂序列来扩增感兴趣的序列。悬垂序列的长度取决于用于吉布森组件的商业套件。如果使用了来自新英格兰Biolabs(NEB)的HIFI组装主混合物,则足够的20个碱基对。
液氮 n/an/a 关键商业检测 NEBuilder® HiFi DNA 组装预混液 New England Biolabs E2621S BsaIHF®v2 (20 U/µL) New England Biolabs R3733S Phusion TM 高保真 DNA 聚合酶 Thermo Fisher Scientific F530S MluI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0561 ApaI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER1411 XhoI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0691 EcoRI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0271 RevertAid TM 逆转录酶 Thermo Fisher Scientific EP0441 RiboLock RNase 抑制剂 (40 U/μL) Thermo Fisher Scientific EO0381 NucleoSpin® 质粒试剂盒 Macherey-Nagel 740588.250 Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒 Zymo Research D4001 Zymo-Spin I Zymo Research C1003-250 嗜热菌 (Tth) DNA 聚合酶 Biotools 10.003 寡核苷酸 D1789 GGGAATCAATCACAGTGTTGGC
β-Mercaptoethanol PanReac-AppliChem A4338,0100 Sodium chloride (NaCl) PanReac-AppliChem 131659.1211 Tryptone Condalab 1612 Yeast Extract Condalab 1702 Bacteriological Agar Condalab 1800 Agarose D1 Medium EEO Condalab 8019 Liquid nitrogen n/a n/a Critical commercial assays NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621S Phusion TM High-fidelity DNA polymerase Thermo Fisher Scientific F530S MluI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0561 BsaIHF®v2 (20 U/µL) New England Biolabs R3733S DNA Clean & Concentrator TM -5 Zymo研究D4004Nucleospin®质粒DNA纯化机构 - 纳格尔740588.250 Ribolock RNase抑制剂(40 u/μl)Thermo Fisher Scientific EO0381恢复TM逆转录(TM)逆转录酶Thero Fisher Fisher Fisher Scientific EP0441 Therus prolainsir prolapers themophirs dna Polymsisriast dna Polymsiss dna Prolymasse:003 3.003.003 3.003 3.003 3.003 3.003 3.003 3.003; 003 3.003 3.003 Nicotiana Benthamiana cas9(Bernabé-ortts等,2019)N/A寡核苷酸D2409 atttatattattAttCataCaatCaaAcc
Panelists: Lindsay Bourgeois , Director of Business Operations & Strategy Director, BioLabs LA at the Lundquist Institute Stephen Cheung , CEO, LAEDC Fran Fulton , Economic Development Manager, City of Torrance Teresa Garcia , Senior Project Manager, City of Pasadena Dan Gober , Executive Director, Biocom California Kelly LoBianco , Director, Department of Economic Opportunity, County of Los Angeles Howard Xu,孵化器开发与规划主任,洛杉矶加利福尼亚州立大学Labiospace微生物学教授
扭曲靶向甲基化系统引入了完整的解决方案,该解决方案产生高度复杂且均匀的测序读数以进行甲基化分析。端到端协议通过结合创新的酶促转换过程,优化目标富集工作流以及高度开发的面板设计过程来实现这一目标。Twist Bioscience与新英格兰Biolabs合作,提供NEBNEXT®EMSEQ(酶促甲基序列)库准备,作为扭曲靶向甲基化系统的一部分。一个简单的工作流修改使二次面板(或尖峰)添加到甲基组中,在研究新应用或表观遗传研究领域时有用。
该产品仅用于研究目的。该产品不打算用于人类或动物的治疗或诊断目的。产品和内容由新英格兰Biolabs,Inc(NEB)拥有或控制的一项或多项专利,商标和/或版权。商标符号的使用并不一定表明该名称在正在阅读的国家 /地区都有商标;它指示了最初开发内容的地方。请参阅www.neb.com/trademarks。使用这些产品可能要求您获得某些应用程序的其他第三方知识产权。有关更多信息,请发送电子邮件至busdev@neb.com。该产品已获得美国PAT下的Bio-Rad Laboratories,Inc。的研究和商业用途。nos。6,627,424,7,541,170,7,670,808,7,666,645,以及其他国家 /地区的相应专利。除下一代测序工作流程中的量化外,没有授予将产品用于数字PCR或实时PCR应用程序的权利。
靶序列,并使用 PrimeSTAR Max(TaKaRa,日本草津)的寡核苷酸和引物 sgRNA-RV 从 pDR274 载体 26 进行 PCR 扩增 sgRNA 模板,并使用 NucleoSpin 凝胶和 PCR 清理试剂盒(MACHEREY-NAGEL,德国迪伦)进行纯化。使用 CUGA7 gRNA 合成试剂盒(日本东京 Nippon Gene)合成 sgRNA,并使用 NanoDrop Lite 分光光度计(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 Thermo Fisher Scientific)测量其浓度。注射溶液由无 RNase 水中三种 sgRNA(每种 20 pg)、Cas9 蛋白(1 nM,M0646,美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室)和酚红(P0290,Sigma-Aldrich)组成。将该溶液注射到1细胞期受精卵或4细胞期胚胎的细胞体中,产生遗传嵌合体,并
1 Anficios的细胞遗传学和生物分子(LICBA)的研究实验室,拉丁美洲卫生研究中心(Ciseal),庞蒂3 Department of Biology, FFCLRP, University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil, 4 Biomedical Research Center (Cenbio), Faculty of Health Sciences Eugenio Espejo, University UTE, Quito, Ecuador, 5 Glyxon Biobs, Mexico City, Coyoacán, Mexico, 6 Laboratory of Environmental Microbiology, Department of Biochemistry and Genomics Microbial,Clemente稳定生物学研究所,蒙得维的亚,乌拉圭,7学院,健康科学学院,Quito,Quito,San Francisco de Quito USFQ USFQ USFQ USFQ USFQ大学,厄瓜多尔,埃库多尔8学院,旧金山8号小学研究所,旧金山大学
使用氯化锌沉淀法(7)从高滴度裂解物中提取 DNA,使用 NEBNext Ultra II 试剂盒(New England Biolabs,马萨诸塞州伊普斯威奇)制备用于测序,并使用匹兹堡噬菌体研究所(宾夕法尼亚州匹兹堡)的 Illumina MiSeq 仪器(v3 试剂)进行测序。对总共 1,056,847 个单端 150 bp 读数进行 9,214 倍覆盖度的测序。分别使用 Newbler v2.9 和 Consed v29.0 进行组装和质量控制检查(8, 9)。PineapplePizza 的基因组有 16,662 个碱基对,G + C 含量为 53.6%。没有测序读数超出基因组末端,基因组末端的 101 bp 反向重复与共价结合的末端蛋白一致,如 phi29(10)。使用 NCBI BLASTn (11) 进行全基因组比对,结果显示与其他 Microbacterium 噬菌体无显著的核苷酸序列相似性,PineapplePizza 被归类为单一基因。使用 Glimmer v3.02 (12) 和 GeneMark v2.5 (13) 自动注释 PineapplePizza 的基因组,然后使用 Phamerator (14)、DNA Master v5.23.6 ( http://phagesdb.org/DNAMaster/ )、PECAAN、BLAST (11) 和 HHPred (15) 手动细化。Aragorn v1.2.38 (16) 或 tRNAscan-SE v2.0 (17) 未鉴定出 tRNA 基因。所有分析均使用默认设置进行。
收到2023年5月19日; 2023年6月20日接受;于2023年7月7日出版了作者分支:1分子微生物学系,约翰·英恩斯中心,诺里奇,诺里奇研究园,NR4 7UH,英国; 2部门生物化学和代谢,蛋白质组学设施,约翰·英恩斯中心,诺里奇,诺里奇研究园,NR4 7UH,英国。*信函:巴里·威尔金森(Barrie Wilkinson),巴里(Barrie)。 Matthew I. Hutchings,Matt。Hutchings@jic。Ac。UKUK关键词:链霉菌;抗生素; actinorhodin;分泌压力;两个组件系统;蛋白质分泌;蛋白质组学。缩写:BGC,生物合成基因簇; DH2O,去离子水; DNA,Difco营养琼脂; DNAD,Difco营养琼脂,补充了D-葡萄糖; NEB,新英格兰Biolabs; QRT-PCR,定量逆转录聚合酶链反应; RR,响应调节器; Sccutrs,S。CoelicolorCutrs; SEC,综合分泌途径; Sgrna,合成指南RNA; SK,传感器组氨酸激酶; Svcutrs,委内瑞拉·卡特斯; TCS,两个组件系统; TMT,串联质量标记; VKOR,维生素K环氧还原酶。芯片SEQ数据登录号= GSE225370(GEO)。TMT蛋白质组学登录号= PXD040579(Pride)。†这些作者对这项工作也同样贡献了本文的在线版本提供补充表。001358©2023作者