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CRISPR/Cas12a (Cpf1) 引导RNA序列的鉴定
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）或 CRISPR 相关（Cas）系统已成为一种主要的基因编辑工具。使用 CRISPR 进行基因编辑需要 Cas 蛋白和相应的向导 RNA（gRNA）。然而，低切割效率和脱靶效应会阻碍 CRISPR/Cas 系统的应用。因此，确定特定的 gRNA 至关重要。在生物传感器应用中，由于 Cas12a（Cpf1）的反式切割活性，CRISPR/Cas12a 可以增强识别靶基因的特异性和灵敏度。mtDNA D 环序列是 mtDNA 中最易变的部分，使其适合区分物种。因此，本研究的目的是通过计算机模拟确定野猪 mtDNA D 环的 gRNA 序列。在 GenBank 数据库的帮助下，使用 Benchling 应用程序预测候选 gRNA。随后，使用 BLAST 核苷酸对 gRNA 候选物进行同源性差异分析，并使用 Jalview 进行错配测试。在几个候选物中，候选物 1 被选为最佳选择，脱靶值为 99.8。与竞争对手的同源性差异分析和与 Sus 属的错配测试分别产生了较高的 E 值和较高的百分比值。这表明候选物不会识别其他物种，但可以检测 Sus scrofa 物种的成员。这些 gRNA 候选物可以选择性地且灵敏地应用于生物传感器，以检测肉类掺假。
Cas12a/Cpf1 敲入小鼠可实现高效多路复用......
1. 美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学医学院遗传学系 2. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学系统生物学研究所 3. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学癌症系统生物学中心 4. 医学博士 (MD-Ph.D.)耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州西黑文 5. 耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州纽黑文 6. 耶鲁大学免疫生物学系，美国康涅狄格州纽黑文 7. 耶鲁大学分子细胞生物学、遗传学与发展项目，美国康涅狄格州纽黑文 8. 耶鲁大学耶鲁学院，美国康涅狄格州纽黑文 9. 耶鲁大学医学院神经外科系，美国康涅狄格州纽黑文 10. 耶鲁大学医学院耶鲁综合癌症中心，美国康涅狄格州纽黑文 11. 耶鲁大学医学院耶鲁干细胞中心，美国康涅狄格州纽黑文 12. 耶鲁大学医学院耶鲁生物医学数据科学中心，美国康涅狄格州纽黑文 ^ 现地址：中国湖南长沙湘雅医学院 * 共同第一作者 @ 通信：
CRISPR/Cpf1 系统的兴起，助力植物高效基因组编辑
Cpf1 是 2 类 CRISPR 家族的内切酶，它填补了 TALEN、ZFN 和 CRISPR/Cas9 等基因组工程工具领域之前面临的空白。其他同时发现的核酸酶无法在同一区域进行重新工程，因为首次工程后会丢失靶位点。Cpf1 充当双核酸酶，既可作为内切核糖核酸酶处理 crRNA，又可作为内切脱氧核糖核酸酶切割靶序列并产生双链断裂。此外，Cpf1 允许多重基因组编辑，因为单个 crRNA 阵列转录本可以靶向基因组中的多个基因座。CRISPR/Cpf1 系统可在单子叶植物和双子叶植物中进行基因删除、插入、碱基编辑和基因座标记，且脱靶效应更少。该工具已在烟草、水稻、大豆、小麦等作物中得到有效验证。本综述介绍了Cpf1介导的基因组编辑技术在植物中的开发和应用。
基因组编辑-Alt -R为CAS12A（CPF1）超核酸酶-Net
图1。Alt-R A.S. CAS12A超蛋白在TTTV目标位点选择方面表现出卓越的性能。 DOTS代表了216个指南的等级编辑效率，该指南靶向TTTV（深色阴影）或TTTN（浅色阴影）PAM站点，并且在输送到HEK-293细胞（96个位点）和陪同下（96个位点）和陪同细胞（96个位点）和野生型CAS12A V3（绿色）V3（绿色）或Cas12a Ultra（蓝色）。 如Alt-R CRISPR-CAS12A用户指南中所指示的RNP 人类细胞使用4D-Nucleofector™System（LONZA）的RNP电穿孔。 使用NGS（Rhampseq Amplicon测序）进行电穿孔后48小时编辑效率。Alt-R A.S. CAS12A超蛋白在TTTV目标位点选择方面表现出卓越的性能。DOTS代表了216个指南的等级编辑效率，该指南靶向TTTV（深色阴影）或TTTN（浅色阴影）PAM站点，并且在输送到HEK-293细胞（96个位点）和陪同下（96个位点）和陪同细胞（96个位点）和野生型CAS12A V3（绿色）V3（绿色）或Cas12a Ultra（蓝色）。人类细胞使用4D-Nucleofector™System（LONZA）的RNP电穿孔。使用NGS（Rhampseq Amplicon测序）进行电穿孔后48小时编辑效率。编辑效率。
Cas12a 使用嵌合 DNA-RNA 向导
CRISPR-Cas9 系统广泛用于靶向基因组工程。Cpf1 是 CRISPR 效应子之一，通过识别富含胸腺嘧啶的原间隔区相邻基序 (PAM) 序列来控制靶基因。Cpf1 对向导 RNA 中的错配的敏感性高于 Cas9；因此，脱靶序列识别和切割较低。但是，它可以容忍原间隔区中远离 PAM 序列 (TTTN 或 TTN) 的区域中的错配，并且当 Cpf1 活性因治疗目的而得到改善时，脱靶切割问题可能会变得更加成问题。在我们的研究中，我们研究了 Cpf1 的脱靶切割，并修改了 Cpf1 (cr)RNA 以解决脱靶切割问题。我们开发了一种 CRISPR-Cpf1，它可以通过用 DNA 部分替换 (cr)RNA 来改变碱基配对的能量势，从而以高度特异性和有效的方式诱导靶 DNA 序列中的突变。提出了一个模型来解释嵌合 (cr)RNA 引导的 CRISPR-Cpf1 和 SpCas9 切口酶如何在细胞内基因组中有效发挥作用。在我们的结果中，当使用嵌合 DNA-RNA 引导进行基因组编辑时，CRISPR-Cpf1 在细胞水平上诱导的脱靶突变较少。这项研究有可能用于治疗无法治愈的癌症
使用API Mellifera中的集成基因编辑系统扩展CRISPR靶向位点
简单摘要：一种多功能基因操纵工具CRISPR/CAS9已被利用用于蜜蜂的靶向基因组工程。但是，到目前为止，仅证明已证明NGG识别的SPCAS9可以操纵A. Mellifera中的基因组，从而将可编辑的范围限制为NGG-包括基因座。在当前的研究中，为了评估使用CPF1，SPCAS9和SACAS9时的潜在扩展，我们通过生物信息学方法预测了整个Honeybee基因组中靶向位点的分布和数量。生物信息学分析的结果表明，A。Mellifera中可访问的目标位点的数量可以通过集成的CRISPR系统大大增加。此外，我们测量了这些新的CRISPR酶在Mellifera中的裂解活性，发现SACAS9和CPF1都可以诱导Mellifera中的基因组交替，尽管CPF1的诱变速率相对较低，而Sacas9的不稳定编辑速率相对较低。据我们所知，我们的研究提供了第一个证据，即SACAS9和CPF1可以有效地介导基因组序列突变，从而扩大了Mellifera中的可靶向光谱。 综合CRISPR系统可能会促进梅利弗拉（A. Mellifera）以及其他昆虫的应用研究。据我们所知，我们的研究提供了第一个证据，即SACAS9和CPF1可以有效地介导基因组序列突变，从而扩大了Mellifera中的可靶向光谱。综合CRISPR系统可能会促进梅利弗拉（A. Mellifera）以及其他昆虫的应用研究。
CRISPR/RNPS- ...
结果：这项研究表明，土壤生长的叶子或愈伤组织衍生的胡椒原生质体是筛选有效的CRISPR/CAS9或CRISPR/CAS12A（CPF1）的有效指南RNA的有用系统。crispr/cas9或cpf1作为纯化的内切核酸酶的CRISPR/RNP复合物与设计的单个指南RNA混合在一起，可以编辑靶基因，camlo2，camlo2，在两个辣椒品种中，具有整个基因组测序，capsicum nuuum nuuum'cm334'和C. annuum'和annuum'dempsey'。在CM334和Dempsey和dempsey和Cleave Camlo2的体外，设计的Guide RNA（Cas9或CRRNA的SGRNA或CRRNA）在Camlo2中保守。crispr /cas9-或 /cpf1-RNP复合物被转染到热胡椒cm334的纯粹分离的原生质体中，并通过PEG介导的递送转染了甜辣椒dempsey。有针对性的深层测序分析表明，根据应用的CRISPR/RNP，在两个品种中都差异地编辑了靶向的Camlo2基因。
使用基于CPF1的富集和牛津纳米技术的Bombyx Mori纤维蛋白重链基因的精确表征
简单的摘要：重要的经济昆虫Bombyx Mori（B。Mori）以其丝绸而闻名。B.莫里丝主要由涂有丝网膜蛋白的丝绸纤维组成。其中，丝绸纤维重链蛋白具有最高的含量和最大的分子量，该蛋白质由丝绸烤重链（FIBH）基因编码。目前，除了B. mori菌株p50t的FIBH的完整序列外，还没有有关该蛋白质的其他报道。这主要是因为FIBH中富含GC的重复序列形成的特殊结构阻碍了聚合酶的扩增和Sanger测序的应用。在这里，通过首席执行官获得了与p50t相似的Dazao的FIBH序列，该序列具有99.98％的相似性。据我们所知，这是中国B. mori菌株的第一个完整的FIBH序列。此外，还确定了FIBH重复单元中的甲基化CG位点。
标题：Protopopoplast 1技术在Phalaenopsis 2
phalaenopsis兰花是全球流行的观赏植物。33个有效的多重基因组编辑工具在Phalaenopsis中的应用将极大地加速34兰花基因功能和育种研究的发展。在这项研究中，我们建立了35个快速，方便的原始原子质体平台，用于识别36个功能基因组编辑工具。两种多重基因组编辑工具PTG-CAS9（PTG，37个Polycistronic TRNA GRNA）和PTGM-CAS9（具有改进的38个SGRNA结构的PTG-CAS9系统）的系统旨在编辑四个目标位置的商业phalaenopsis 39 ST166的PDS基因。我们发现，PTG-CAS9和PTGM-CAS9系统在Phalaenopsis中均具有40个功能，并且具有改性SGRNA的PTGM-CAS9系统具有比PTG-CAS9系统高41个编辑效率。此外，我们设计了另一种多重42基因组编辑工具，称为DPⅱ-CPF1系统（双Pol II启动子驱动CPF1核酸内核酸酶和CRRNA的43个表达），以编辑四个44个44个目标位点的phaenopsis的PDS基因。所有四个目标均通过DPⅱ-CPF1系统有效地编辑，而45总突变率约为PTGM-CAS9系统的3倍。使用Phalaenopsis Protoplast平台一起使用了46个，我们成功地建立了两个47个有效的多路复用基因组编辑工具，用于Phalaenopsis研究，PTGM-CAS9和48DPⅱ-CPF1。本研究中建立的多重基因组编辑工具在有效地构建大规模敲除突变库中具有巨大的49个应用潜力。51
CcdB 毒素是 CRISPR 的有效选择标记...
蓝藻是唯一能够进行产氧光合作用的原核生物，是重要的初级生产者，在农业、水生生态和环境保护领域发挥着关键作用。它们多功能的代谢使它们成为各种生物技术应用的有趣候选者。最近，通过基于 CRISPR 的方法的发展，它们的基因操作领域取得了巨大进展。然而，大多数可用的质粒都很难操作，这使得它们的使用具有挑战性。在本研究中，我们使用 CcdB 毒素作为选择标记来改进用于蓝藻基因组编辑的基于 Cpf1 的质粒。我们的结果表明，这种选择提高了质粒构建的成功率，从而提高了基因组编辑的成功率。