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人类 T 细胞的大规模并行敲入工程
靶向基因敲入在细胞治疗中的应用效率普遍较低，规模有限。本研究开发了CLASH系统，该系统能够实现高效、高通量的基因敲入工程。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与混合腺相关病毒结合，通过大规模并行同源定向修复介导同时基因编辑和精准转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体池，每个变体都具有靶向基因编辑功能。我们将该技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了时间进程式CLASH实验，从而实现了有利的CAR-T变体的混合生成和无偏选择。 CLASH 实验中出现了一种独特的 CRISPR RNA (crRNA)，它可以在 CAR-T 中生成 PRDM1 的外显子 3 跳跃突变，从而增强这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命，从而在多种癌症模型（包括实体瘤模型）中提高体内疗效。CLASH 的多功能性使其广泛应用于各种细胞和治疗工程应用。
使 ipsc 衍生细胞疗法的设计成为可能...
并表征重组 MAD7 以用于我们 iPSC 基因编辑平台中的核糖核蛋白 (RNP)。我们的工艺产生的蛋白质在配制后在溶液中是均质和单体的。此外，通过生物物理和功能表征测量，蛋白质稳定性在 -8080 C 下保持 6 个月。重组产生的 MAD7 的活性在 iPSC 中多个基因座的敲除 (KO) 和同源定向修复 (HDR) 效率方面与 Cpf1 相当。我们已经生成并测试了针对基因组中不同位点的多个 gRNA，并证明 MAD7 不会引起任何结构异常，这通过正交遗传表征测定确定。数据表明，重组 MAD7 CRISPR 核酸酶可以有效表达、纯化和配制，从而能够将哺乳动物细胞稳健而精确地改造为核糖核蛋白 (RNP)。我们目前正在使用我们的 MAD7 优化工艺来生成 MAD7 RNP，以便对具有多个基因编辑的治疗性 iPSC 衍生的 NK 和 T 细胞候选产品进行基因工程改造。Hunter Hoffman、Jill M. Carton、Buddha Gurung、Justin Bianchini、Shelby Keating、Michael F. Naso、Luis Borges
MECP2 的多重表观基因组编辑可拯救 Rett 综合征神经元
雷特综合征 (RTT) 是一种 X 连锁神经发育障碍，由年轻女性 X 染色体上的甲基 CpG 结合蛋白 2 ( MECP2 ) 的功能丧失杂合突变引起。从失活的 X 染色体 (Xi) 重新激活沉默的野生型 MECP2 等位基因代表着对女性 RTT 患者的一个有希望的治疗机会。在这里，我们应用了一种多重表观基因组编辑方法，从 RTT 人胚胎干细胞 (hESC) 和衍生的神经元中重新激活 Xi 中的 MECP2。通过 dCas9-Tet1 和靶向单向导 RNA 对 MECP2 启动子进行去甲基化，从 RTT hESC 中的 Xi 重新激活 MECP2，而在转录水平上没有可检测到的脱靶效应。来自甲基化编辑的 RTT hESC 的神经元维持了 MECP2 的再激活，并逆转了 RTT 的两个特征：体细胞尺寸变小和电生理异常。在 RTT 神经元中，通过 dCpf1-CTCF（与 CCCTC 结合因子融合的催化死亡 Cpf1）和靶 CRISPR RNA 隔离甲基化编辑的 MECP2 基因位点可增强 MECP2 的再激活并挽救 RTT 相关的神经元缺陷，为表观基因组编辑治疗 RTT 和其他潜在的显性 X 连锁疾病提供了概念验证研究。
迷你评论
大学。东京，日本东京都文京区本乡 7-3-1，邮编 113-0033 通讯作者：Hiroshi Nishimasu，nisimasu@bs.s.u-tokyo.ac.jp 电话：+81-3-5841-4391 收稿日期：2018 年 1 月 8 日/修订日期：2018 年 2 月 17 日/接受日期：2018 年 2 月 17 日 摘要 RNA 引导的核酸内切酶 Cas9 参与原核生物 CRISPR-Cas 过继免疫系统，可与引导 RNA 结合并切割与 RNA 引导互补的双链 DNA。近年来，Cas9 已被用作从基础研究到临床应用等广泛领域的多功能基因组编辑工具。然而，Cas9 识别和切割 DNA 的分子机制尚不清楚，其在基因组编辑中的应用仍有许多问题有待解决。我们阐明了最广泛用于基因组编辑的 S. pyogenes Cas9 与向导 RNA 及其靶 DNA 复合的晶体结构，从而首次深入了解了 Cas9 介导的 DNA 切割机制。此外，我们还解决了来自三种不同细菌的 Cas9 核酸酶和 Cas12a (Cpf1) 核酸酶的晶体结构，它们也用于基因组编辑。总的来说，这些结构研究阐明了 CRISPR-Cas 核酸酶的机制趋同和发散，为
新型抗危机辅助CRISPR生物传感器，用于独家检测单链DNA（ssDNA）
摘要：核酸分析在疾病诊断和治疗中起重要作用。CRISPR技术的发现为检测核酸的检测提供了新颖而多功能的方法。但是，使用最广泛的CRISPR-CAS12A检测平台缺乏将单链DNA（ssDNA）与双链DNA（DSDNA）区分开的能力。为了克服这一局限性，我们首先采用了抗Crispr蛋白（ACRVA1）来开发一种新型的CRISPR生物传感器，以专门检测ssDNA。在这种传感策略中，ACRVA1切割CRISPR指南RNA（CRRNA）抑制CRISPR-CAS12A系统的裂解活性。只有ssDNA具有募集裂解的crRNA片段以恢复CRISPR-CAS12生物传感器的检测能力，但DSDNA无法实现这一目标。通过测量CRISPR-CAS12A生物传感器的回收裂解活性，我们开发的ACRVA1辅助CRISPR生物传感器能够将ssDNA与dsDNA区分开，为检测SSDNA的检测提供了一种简单可靠的方法。此外，我们证明了我们开发的ACRVA1辅助CRISPR生物传感器，以监测解旋酶的酶促活性并筛选其抑制剂。关键字：基于CRISPR的生物传感器，CAS12A（CPF1）核酸酶，抗Crispr蛋白，ACRVA1，单链DNA（SSDNA）
背景：什么是 CRISPR/Cas？
在细菌中，CRISPR/Cas 系统作为抵御入侵病毒的免疫防御。 CRISPR/Cas 帮助细菌“记住”过去的病毒感染，并在发生新的病毒感染时作为一种防御策略。简单来说，就是病毒基因组的片段整合到细菌基因组中，使得细菌在反复感染病毒的过程中能够识别并切割病毒基因组。该细菌系统已被广泛研究并适用于实验室中的分子生物学应用。 CRISPR/Cas系统从其原有的单细胞生物功能中分离出来，用于细胞培养和多细胞生物中的应用。 CRISPR/Cas 系统天然存在于许多不同的细菌属中，每种细菌属都有自己的结构和酶特性。科学家正在利用这一点进一步开发 CRISPR/Cas 作为一种分子生物学技术，以便可以专门到达和修改越来越多的基因组区域。基因组编辑中最广泛使用的 CRISPR/Cas 系统是来自化脓性链球菌的 CRISPR/Cas9。然而，其他 CRISPR/Cas 变体如 CRISPR/Cpf1 也用于扩展基因组编辑或 CRISPR/Cas13 修饰 RNA 的应用可能性。
从阅读到演讲再到评价：CRISPR/Cas是基因工程吗？
在细菌中，CRISPR/Cas 系统作为抵御入侵病毒的免疫防御。 CRISPR/Cas 帮助细菌“记住”过去的病毒感染，并在发生新的病毒感染时作为一种防御策略。简单来说，就是病毒基因组的片段整合到细菌基因组中，使得细菌在反复感染病毒的过程中能够识别并切割病毒基因组。该细菌系统已被广泛研究并适用于实验室中的分子生物学应用。 CRISPR/Cas系统从其原有的单细胞生物功能中分离出来，用于细胞培养和多细胞生物中的应用。 CRISPR/Cas 系统天然存在于许多不同的细菌属中，每种细菌属都有自己的结构和酶特性。科学家正在利用这一点进一步开发 CRISPR/Cas 作为一种分子生物学技术，以便可以专门到达和修改越来越多的基因组区域。基因组编辑中最广泛使用的 CRISPR/Cas 系统是来自化脓性链球菌的 CRISPR/Cas9。然而，其他 CRISPR/Cas 变体如 CRISPR/Cpf1 也用于扩展基因组编辑或 CRISPR/Cas13 修饰 RNA 的应用可能性。
细菌CRISPR/CAS9系统作为所有健康问题的有希望的解决方案，并进步的生物工程
缩写：BP1，肿瘤抑制剂p53结合蛋白1； BRCA，乳腺癌抗原；汽车，嵌合抗原受体； CAS9，CRISPR相关蛋白9;级联，抗病毒防御的CRISPR综合体； CMR，CAS模块坡道（重复相关的神秘蛋白质）； CMR III-B，多个亚基III型B CRISPR RNA-CAS蛋白； CPF1，Prevotella和Francisella1的CRISPR； CRISPR，定期间隔间隔室； Crrna，Crispr RNA； CSM III-A，多支亚基III-A CRISPR-CAS蛋白； dcas9/ sgrna-sg I，停用cas9/短指南RNA-Sybrr-green i; DNA-PK，DNA-蛋白K; DNA-PKC，DNA蛋白K催化亚基； DSB，双链断裂； ege，额外的基因元素； GRNA，导向RNA； HDR，同源性维修； IAP，碱性磷酸酶同工酶； MRE 11，减数分裂重组11; NHEJ，非同理结局加入； PAM，原始间隔者相邻基序； PD，程序性细胞死亡； RAD，重组酶A；代表，重复的外部回文； RPA，复制蛋白A； RT，逆转录酶； Sgrna，简短的指南RNA； SSB，单链断裂； tracrrna，反式激活CRISPR RNA； XLF，类似XRCC4的因子； XRCC 4，X射线修复交叉补充蛋白4； Yoyo-1，（恶唑黄色）
基因编辑技术的进展
随着大核酸酶、锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR/Cas 等工具的发展，精确修改人类基因的能力已经成为可能。这些技术现在使得产生靶向缺失、插入、基因敲除和点变异成为可能；通过将转录因子或表观遗传机制靶向 DNA 来调节基因表达；或靶向和修改 RNA。内源性修复机制用于对 DNA 进行所需的修改；它们包括非同源末端连接、同源性定向修复、同源性独立的靶向整合、微同源性介导的末端连接、碱基切除修复和错配修复。可以使用计算机预测和测序来监测脱靶效应，并使用具有更高精度的 Cas 蛋白（例如高保真度 Cas9、增强特异性 Cas9 和超精确 Cas9）将其最小化。已发现 Cas9 的替代品，包括 Cpf1、Cas12a、Cas12b 和较小的 Cas9 直系同源物（如 CjCas9）。基因编辑成分的递送是使用标准技术在体外进行，或使用 AAV、脂质纳米颗粒或细胞穿透肽在体内进行。基因编辑技术的临床开发正在多个领域取得进展，包括癌症治疗中的免疫疗法、HIV 感染的抗病毒疗法以及治疗遗传性疾病，如 b 地中海贫血、镰状细胞病、溶酶体贮积症和视网膜营养不良症。我们在此回顾这些技术进步及其临床实施面临的挑战。
Cas12a 直系同源物和工程变体的高通量分析，以增强基因组编辑活性
摘要：CRISPR/Cas12a（以前称为 Cpf1）是一种 RNA 引导的 VA 类 CRISPR 系统内切酶，为基因组工程提供了一种有前途的工具。目前已鉴定出 10 多个 Cas12a 直系同源物，并用于人类细胞的基因编辑。然而，新兴 Cas12a 直系同源物之间的功能多样性仍未得到充分探索。本文，我们通过构建包含 40,000 多个引导 RNA 的基因组整合、自切割、配对 crRNA 靶标文库，报告了 16 个 Cas12a 直系同源物在人类细胞中的编辑活性的高通量比较分析。三种 Cas12a 候选物由于其结构紧凑且编辑效率与 AsCas12a 和 LbCas12a 相当而表现出良好的潜力，而 AsCas12a 和 LbCas12a 的特征已得到充分表征。我们通过结构引导的蛋白质工程生成了三种精氨酸替代变体 (3Rv)：BsCas12a-3Rv (K155R/N512R/K518R)、PrCas12a-3Rv (E162R/N519R/K525R) 和 Mb3Cas12a-3Rv (D180R/N581R/K587R)。与野生型 Cas12a 效应子相比，这三种 Cas12a 变体均表现出增强的编辑活性和扩大的靶向范围 (NTTV、NTCV 和 TRTV)。三种 Cas12a 变体之间的碱基偏好分析表明，PrCas12a-3Rv 在具有典型 PAM TTTV 和非典型 PAM TTCV 的靶位点上表现出最高活性，而 Mb3Cas12a-3Rv 表现出与其他变体不同的识别特征，在 PAM TATV 的 -3 位置和 PAM ATCV 的 -4 位置容纳更多的核苷酸 A。因此，扩展的 Cas12a 工具箱和对 Cas12a 活动的更好理解应该有助于它们在基因组工程中的应用。