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CcdB 毒素是 CRISPR 的有效选择标记...
蓝藻是唯一能够进行产氧光合作用的原核生物，是重要的初级生产者，在农业、水生生态和环境保护领域发挥着关键作用。它们多功能的代谢使它们成为各种生物技术应用的有趣候选者。最近，通过基于 CRISPR 的方法的发展，它们的基因操作领域取得了巨大进展。然而，大多数可用的质粒都很难操作，这使得它们的使用具有挑战性。在本研究中，我们使用 CcdB 毒素作为选择标记来改进用于蓝藻基因组编辑的基于 Cpf1 的质粒。我们的结果表明，这种选择提高了质粒构建的成功率，从而提高了基因组编辑的成功率。
ErCas12a CRISPR-MAD7 用于人类细胞、小鼠和大鼠的模型生成
摘要 MAD7 是从直肠真杆菌中分离出来的一种工程化的 2 类 VA 型 CRISPR-Cas (Cas12a/Cpf1) 系统。与 Cas9 类似，它是一种 RNA 引导的核酸酶，在大肠杆菌和酵母细胞中具有基因编辑活性。本文报告称，MAD7 能够分别在人类 HCT116 和 U2OS 癌细胞系中产生内源基因的插入/缺失和荧光基因标记。此外，MAD7 非常擅长在小鼠和大鼠胚胎中产生插入/缺失、小 DNA 插入（23 个碱基）和 1 至 14 kb 大小的较大整合，从而产生活产转基因动物。由于不同的原间隔区相邻基序要求、小引导 RNA 和高效的靶向基因破坏和插入，MAD7 可以扩展 CRISPR 工具箱，用于跨不同系统和模型生物进行基因组工程。
使用AI
协助Biotech客户在筹款期间为VC投资者提供IP策略，然后成功进行IPO，然后成功进行IPO。在成功防御CRISPR CPF1专利（PGR2018-00072）的授予后审查方面的副主席。在成功辩护的六个党派评论中，由普通请愿人对橙色书上列出的药品专利进行的六个片段审查，该专利涵盖了涵盖1亿美元的控制释放产品（IPR2013-00368，IPR2013-00371，ipr2013-00371，and IPR2013-00372），并在IPR2013-00372 - 所有索赔决定; IPR2015-01777，IPR2015-01778和IPR2015-01782 - 未建立）。 起诉了橙皮书中列出的产品组合，并在随后的诉讼中保持有效。 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd.诉John Doll（Fed。） cir。 2009） - 在先例的2-1裁决中，由专利重新审查引起的双重专利拒绝（所有索赔均可在还押后获得专利）。由普通请愿人对橙色书上列出的药品专利进行的六个片段审查，该专利涵盖了涵盖1亿美元的控制释放产品（IPR2013-00368，IPR2013-00371，ipr2013-00371，and IPR2013-00372），并在IPR2013-00372 - 所有索赔决定; IPR2015-01777，IPR2015-01778和IPR2015-01782 - 未建立）。起诉了橙皮书中列出的产品组合，并在随后的诉讼中保持有效。Takeda Pharmaceutical Co. Ltd.诉John Doll（Fed。） cir。 2009） - 在先例的2-1裁决中，由专利重新审查引起的双重专利拒绝（所有索赔均可在还押后获得专利）。Takeda Pharmaceutical Co. Ltd.诉John Doll（Fed。cir。2009） - 在先例的2-1裁决中，由专利重新审查引起的双重专利拒绝（所有索赔均可在还押后获得专利）。
预测使用机器学习靶向定位的CRISPR-CAS12A指南
通过开发CRISPR（定期间隔的短质体重复重复）的基因组编辑 - CAS技术彻底改变了生物学领域的许多领域。超过Cas9核酸酶，Cas12a（以前是CPF1）已成为CAS9编辑富含基因组的有希望的替代方法。尽管有承诺，但通过计算工具搜索指导RNA效率预测仍然缺乏准确性。通过计算元分析，我们报告说CAS12A靶标和脱靶裂解行为是核苷酸偏置的因素，相对于原始的邻接基序（PAM）相对于核苷酸不匹配。这些功能有助于训练一个随机的森林机器学习模型，以将准确性提高至少15％，而不是现有算法，以预测CAS12A酶的指导RNA效率。尽管有进展，但我们的报告强调了对更多代表性数据集的需求，并进一步进行基准测试，以可靠，准确地预测CAS12A酶的RNA效率和脱靶效应。
改进的 LbCas12a 变体具有改变的 PAM 特异性......
Cas12a（以前称为 Cpf1）核酸酶在基因组工程中的广泛使用受到它们需要相当长的 TTTV 原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列的限制。在这里，我们旨在放宽这些 PAM 限制，并通过将其相应的 RR 和 RVR 变体的突变与改变的 PAM 特异性相结合，生成了在哺乳动物和植物细胞中活跃的四种 Cas12a 直系同源物的新型 PAM 突变变体。选择表现出最高活性的 LbCas12a-RVRR，使用基于质粒的测定法深入表征其在哺乳动物细胞中的 PAM 偏好。LbCas12a-RVRR 的共识 PAM 序列类似于 TNTN 基序，但也包括 TACV、TTCV CTCV 和 CCCV。经发现，改良的 LbCas12a (impLbCas12a) 中的 D156R 突变以 PAM 依赖的方式进一步提高了该变体的活性。由于 impLbCas12a 和最近报道的 enAsCas12a 变体的 PAM 偏好重叠但仍有差异，它们相互补充，为基因组编辑和转录组调节应用提供了更高的效率。
CAS12A应用在细菌中的最新进展
抽象聚类定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）介导的基因组工程和相关技术在过去十年中彻底改变了生物技术，通过提高了复杂的生物系统的效率。cas12a（CPF1）是与许多原核生物中发现的CRISPR自适应免疫系统相关的RNA引导的内切酶。与其更突出的对应物Cas9相反，Cas12a识别富含DNA序列，并能够直接处理其相应的指南RNA，从而使其成为多重基因组编辑工作和其他应用于生物技术中的多功能工具。虽然CAS12A已在真核细胞系统中广泛使用，但微生物应用仍然受到限制。在这篇综述中，我们强调了Cas12a和Cas9之间的机械和功能差异，并着重于使用CAS12A在细菌宿主中使用CAS12A的最新应用。此外，我们讨论了优势以及当前的挑战，并为这种有希望的替代CRISPR-CAS系统提供了未来的前景，用于细菌基因组编辑及其他挑战。
热诱导 CRISPR/Cas12b (C2c1) 的应用......
摘要 CRISPR/Cas9 和 Cas12a (Cpf1) 工具已大规模用于基因组编辑。最近建立了一种具有单个核酸酶结构域、相对较小尺寸、低频率脱靶效应和高温下切割能力的新效应物，并将其命名为 CRISPR/Cas12b (C2c1)。Cas12b 还表现出在哺乳动物系统中的温度诱导性。因此，该系统对于编辑耐高温植物物种（如棉花）的基因组具有潜在价值。利用这种新系统，在一系列温度下通过农杆菌介导的遗传转化成功生成了陆地棉突变体。暴露在 45°C 下 4 天的转化子（被农杆菌感染的外植体）显示出最高的编辑效率。全基因组测序未检测到脱靶突变。T0 代中 AacCas12b 进行的基因组编辑忠实地传递给了 T1 代。综上所述，CRISPR/Cas12b 是一种高效、精确的棉花基因组编辑工具。
Hs1Cas12a 和 Ev1Cas12a 赋予高效的基因组...
Cas12a，也称为 Cpf1，是一种用途广泛的 CRISPR-Cas 酶，已广泛应用于基因组编辑。与其众所周知的对应物 Cas9 不同，Cas12a 具有独特的功能，使其成为富含 AT 的基因组区域的高效基因组编辑工具。为了丰富 CRISPR-Cas12a 植物基因组编辑工具箱，我们探索了 17 种新的 Cas12a 直系同源物在植物中的基因组编辑能力。其中，Ev1Cas12a 和 Hs1Cas12a 在水稻和番茄原生质体中表现出有效的多重基因组编辑。值得注意的是，Hs1Cas12a 对低温表现出更高的耐受性。此外，Hs1Cas12a 在水稻 T 0 植物中产生了高达 87.5% 的双等位基因编辑。 Ev1Cas12a 和 Hs1Cas12a 均在杨树 T 0 植物中实现了有效编辑，尽管嵌合性较高，但高达 100% 的植物都得到了编辑。总而言之，Ev1Cas12a 和 Hs1Cas12a 在单子叶植物和双子叶植物中表现出的高效基因组编辑凸显了它们作为植物物种及其他物种中有前途的基因组编辑工具的潜力。
改进的 LbCas12a 变体具有改变的 PAM 特异性......
Cas12a（以前称为 Cpf1）核酸酶在基因组工程中的广泛使用受到它们需要相当长的 TTTV 原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列的限制。在这里，我们旨在放宽这些 PAM 限制，并通过将其相应的 RR 和 RVR 变体的突变与改变的 PAM 特异性相结合，生成了在哺乳动物和植物细胞中活跃的四种 Cas12a 直系同源物的新型 PAM 突变变体。选择表现出最高活性的 LbCas12a-RVRR，使用基于质粒的测定法深入表征其在哺乳动物细胞中的 PAM 偏好。LbCas12a-RVRR 的共识 PAM 序列类似于 TNTN 基序，但也包括 TACV、TTCV CTCV 和 CCCV。经发现，改良的 LbCas12a (impLbCas12a) 中的 D156R 突变以 PAM 依赖的方式进一步提高了该变体的活性。由于 impLbCas12a 和最近报道的 enAsCas12a 变体的 PAM 偏好重叠但仍有差异，它们相互补充，为基因组编辑和转录组调节应用提供了更高的效率。
非洲优良水稻品种的基因组编辑使其能够抵抗地方性和新兴的稻瘟病病原菌菌株
由水稻白叶枯病 (BB) 病原菌 (Xoo) 引起的水稻细菌性叶枯病威胁着全球粮食安全和小规模水稻生产者的生计。对来自亚洲、非洲和美洲的 Xoo 样本的分析表明，尽管全球大米贸易强劲，但其分布却呈现出令人惊讶的大陆隔离现象。本文，我们报告了坦桑尼亚前所未有的 BB 疫情。与地方性的 Xoo 不同，病原菌株携带针对蔗糖转运蛋白 SWEET11a 并抑制 Xa1 的亚洲型 TAL 效应物。系统基因组学将这些菌株与来自中国的 Xoo 菌株聚集在一起。非洲水稻品种没有携带合适的抗性基因。为了保护非洲水稻生产免受这种新出现的威胁，我们开发了一种混合 CRISPR-Cas9/Cpf1 系统来编辑东非优良品种 Komboka 的三个 SWEET 启动子中的六个 TALe 结合元素。经过编辑的品系表现出对亚洲和非洲Xoo菌株的广谱抗性，包括最近在坦桑尼亚发现的菌株。这一策略可能有助于保护全球水稻作物免受BB大流行的影响。