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基于突变独立的 CRISPR/Cas9“敲除...
视紫红质 (RHO) • 一种参与视杆细胞视觉光传导的光敏受体蛋白 • 位于视杆细胞的外节 • 大约 30%（美国和英国）的 adRP 由 RHO 显性突变引起 • 患病率：美国有 7,500 名患者，欧盟和英国有 12,100 名患者 • RHO 基因中发现的 >150 个突变导致 RHO-adRP 1
CRISPR 情况说明书 CSU
1.) Ishino, Y.、Shinagawa, H.、Makino, K.、Amemura, M. 和 Nakata, A. (1987)。负责大肠杆菌碱性磷酸酶同工酶转化的 iap 基因的核苷酸序列以及该基因产物的鉴定。J. Bacteriol. 169:5429-5433 2.) Jansen, R.、van Embden, JDA、Gaastra, W. 和 Schouls, LM (2002)。在原核生物中鉴定一种新型序列重复家族。OMICS 6:23-33 3.) Schaeffer, SK 和 Nakata, PA (2015)。CRISPR/Cas9 介导的植物基因组编辑和基因替换：从实验室到田野的转变。植物科学。 240:130-142 4.) Gomaa, AA, Klumpe, HE, Luo, ML, Selle, K., Barrangou, R. 和 Beisel, CL (2014) 使用基因组靶向 CRISPR-Cas 系统可编程去除细菌菌株。mBio 5(1):e00928-13 5.) Cui, L. 和 Bikard, D. (2016). Cas9 切割对大肠杆菌染色体的影响。Nucleic Acids Res. 44(9):4243-4251 6.) Yang, H., Jia, M., Geornaras, I., Woerner, DR, Morley, PS 和 Belk, KE (2017). 扩展 CRISPR-Cas9 系统在牛肉生产中序列特异性消除食源性病原体的能力。最终报告由美国科罗拉多州立大学肉类安全与质量中心提交给美国全国牛肉协会，科罗拉多州柯林斯堡，24 页。7.) Yang, H., Jia, M., Geornaras, I., Woerner, DR, Morley, PS 和 Belk, KE (2018)。构建噬菌体介导系统以递送 CRISPR-Cas9 抗菌剂，从而针对序列特异性地消除牛肉生产中的食源性病原体。最终报告由美国科罗拉多州立大学肉类安全与质量中心提交给美国全国牛肉协会，科罗拉多州柯林斯堡，32 页。8.) Luo, ML, Leenay, RT 和 Beisel, CL (2016)。基于 CRISPR 的细菌工具的现状和未来前景。生物技术与生物工程。113(5):930-43。 9.) de la Fuente-Núñez, C. 和 Lu, TK (2017)。CRISPR-Cas9 技术：在基因组工程中的应用、序列特异性抗菌药物的开发以及未来前景。Integr Biol (Camb)。9(2):109-122。10.) Es, I.、Gavahian, M.、Marti-Quijal, FJ、Lorenzo, JM、Khaneghah, AM、Tsatsanis, C.、Kampranis, SC 和 Barba, FJ (2019)。CRISPR-Cas9 基因组编辑机制在食品和农业科学中的应用：现状、未来前景和相关挑战。Biotechnol. Adv. 37:410-421 11.) Van der Berg, JP、Kleter, GA、Battaglia, E.、Groenen, MAM 和 Kok, EJ (2020)。牛基因改造的发展及其对监管、安全和可追溯性的影响。农业科学工程前沿 7:136-147 12.) Yang, H., Dong, J., Geornaras, I., Thomas, MG, Prenni, JE & Belk, KE (2021). 使用基于组学的分析方法和牛细胞系模型系统评估和减轻基于 CRISPR-Cas9 的靶向杀灭系统在肉牛生产中的潜在生物安全风险。科罗拉多州立大学肉类安全与质量中心（科罗拉多州柯林斯堡）提交给美国全国牛肉协会的最终报告，58 页。
CRISPR/Cas9 介导的颗粒诱变......
摘要：马铃薯 ( Solanum tuberosum L.) 是继水稻和小麦之后的第三大重要粮食作物。其块茎富含以淀粉形式存在的膳食碳水化合物，具有多种工业应用。淀粉由直链淀粉和支链淀粉两种多糖组成，它们的比例决定了不同的特性和功能。支链淀粉含量较高的马铃薯品种具有多种食品加工和工业应用。利用农杆菌介导的转化技术，我们将成簇的规律间隔短回文重复序列和 CRISPR 相关蛋白 9 (CRISPR/Cas9) 试剂递送到马铃薯 (品种 Yukon Gold) 细胞中，以破坏颗粒结合淀粉合酶 ( gbssI ) 基因，目的是消除淀粉的直链淀粉成分。块茎的卢戈氏碘染色表明，在一些编辑事件中直链淀粉减少或完全消除。高氯酸和酶法进一步证实了这些结果。一个事件 (T2-7) 显示所有四个 gbss 等位基因均发生突变，块茎中的直链淀粉被完全消除。使用快速粘度分析仪 (RVA) 测定了来自六个不同敲除事件的块茎淀粉的粘度曲线，这些值反映了支链淀粉/直链淀粉的比例。后续研究将重点关注从事件中消除 CRISPR 成分，并评估具有各种直链淀粉/支链淀粉比例的克隆在食品加工和其他工业应用中的潜力。
CRISPR 助力可持续农业
“可持续农业”一词涵盖了在不损害自然环境和农民社会经济条件的情况下生产高质量和安全农产品的农业实践。根据加州大学戴维斯分校农业可持续发展研究所 ( https://www.nal.usda.gov/legacy/afsic/sustainable-agriculture-definitions-and-terms ，2022 年 1 月 10 日访问 ) 的说法，可持续农业的主要目标仍然是保护子孙后代满足自身需求的能力，确保包容性经济增长。在气候变化时代，环境威胁将在经济和农艺层面影响农民，影响作物产量和质量，并进一步对植物对非生物和生物胁迫的抵抗力产生负面影响。为了应对这些环境威胁，并有机会实现工业制造的可持续生产，将在生物技术领域现有知识的基础上使用新技术。成簇的规律间隔回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 代表了基因工程的新视角和新育种技术 (NBT) 和基因组编辑 (GE) 工具的最后前沿。
CRISPR/Cas 介导的顺式工程观点......
评论 [QL1]：嗨，Esther，我知道你的意思。但我们在图 1D 中展示了这个例子。这是交换天然启动子以改良作物的唯一一个例子。所以这是图 1D 的一个很好的例子。考虑到这一点，我们应该在这里保留“交换”。
CRISPR/CAS9介导的基因组编辑
抽象CRISPR/CAS9介导的基因组编辑是发现所需基因的最重要的分子工具之一。它已经迎来了一个新的基因疗法可能性的新时代。CRISPR/CAS9系统最初是细菌自适应免疫系统的一部分。后来，它适应了对人类细胞中DNA的精确和靶向改变，用于纠正基因疗法，以纠正遗传疾病并治疗与遗传变化相关的各种严重疾病。除此之外，CRISPR/CAS9系统还用于药物基因组学来基于患者的基因开发新药，在开发基于CRISPR的COVID-9测试方面修改了研究生物，甚至用于诊断目的。FDA最近批准了CRISPR/CAS9细胞基因疗法“ Casgevy”治疗镰状细胞贫血是CRISPR/CAS9系统在开发创新基因疗法中的潜力的证明。本综述详细介绍了CRISPR/CAS9基因编辑的机制及其在正在进行的临床试验中的利用，不仅在治疗诸如镰状细胞疾病，丘疹疾病和遗传失明等单基因疾病中，还可以治疗多因素疾病，例如癌症，糖尿病，自动疾病，自动疾病，病毒性疾病，病毒性疾病，病毒性疾病，病毒性疾病，病毒性疾病，病毒性疾病，病毒性疾病，病毒性疾病（HIV）等。还尝试讨论临床环境中基于CRISPR/CAS9的基因疗法的各种局限性，挑战和道德框架。关键字：基因治疗，CRISPR/CAS9，CAR-T细胞，核酸内切酶，同源指导的修复，非同源末端连接，基因敲除，基因敲门，临床试验，伦理
用于眼部血管生成的 CRISPR 技术
在基因组工程工具中，基于成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 的方法因其稳健性、精确性和易用性而被广泛用于转化研究。当使用病毒载体（如腺相关病毒）将 CRISPR 递送至患病组织时，可以有效地在体内实现直接基因组编辑，以治疗不同的眼科疾病。尽管 CRISPR 已被积极探索作为治疗遗传性视网膜疾病的策略，并且最近启动了首次人体试验，但它在眼部血管生成等复杂、多因素疾病中的应用相对有限。目前，新生血管性视网膜疾病（如早产儿视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变和新生血管性年龄相关性黄斑变性）共同构成了发达国家失明的大多数，通过频繁且昂贵的抗血管内皮生长因子 (anti-VEGF) 药物进行治疗，这些药物的疗效短暂且给患者带来负担。相比之下，CRISPR 技术有可能永久抑制血管生成，同时还具有靶向细胞内信号或调节元件、细胞特异性传递和多路复用以同时破坏不同促血管生成因子的额外优势。然而，永久抑制生理途径的前景、基因编辑效率的不可预测性以及对脱靶效应的担忧限制了人们对这些方法的热情。在这里，我们回顾了基因治疗的发展和采用 CRISPR 平台抑制视网膜血管生成的进展。我们讨论了不同的 Cas9 直系同源物、传递策略和不同的基因组靶点，包括 VEGF、VEGF 受体和 HIF-1 α，以及基因组编辑与传统基因疗法相比在多因素疾病过程和单基因遗传性视网膜疾病方面的优缺点。最后，我们描述了必须克服的障碍，以便有效采用基于 CRISPR 的策略来管理眼部血管生成。
如何制作CRISPR牛
时机是这项研究的目标之一，就是在受精后立即编辑早期胚胎，以避免一种称为遗传镶嵌的疾病。当两个或多个具有不同基因型的细胞中存在于单个受精卵中发展的个体中时，就会发生镶嵌。这通常发生在胚胎开始在第一个细胞分裂之前复制自己的DNA时进行编辑时。为了避免在这项研究中避免镶嵌性，在授精后六个小时以及在DNA合成开始之前，将指南，供体和Cas9蛋白质编辑摄入被引入牛胚胎中。对于希望将基因插入胚胎插入基因的研究人员的挑战之一是逃避细胞的主要DNA修复途径。在胚胎发育的早期阶段，修复倾向于通过NHEJ途径，而HDR编辑效率在早期胚胎中非常低。
CRISPR/Cas 用于作物改良∗
CRISPR/Cas 技术与 TALEN、ZFN 和归巢内切酶等其他基因编辑系统一起，是所有类型生物（从微生物、植物到动物）基因组改造的首选，在工业、基础研究和医学等不同领域有着无数的应用。近年来，这种基因编辑技术已用于靶向拟南芥、水稻、玉米、大豆和烟草等多种作物的多个基因，以生产具有改良性状（如产量增加、生物和非生物胁迫耐受性、食品质量改善）的新品种。与生产优良植物（非转基因）的基因工程相比，该技术的优势在于可以避免与公众接受这些植物相关的严格监管测试和伦理问题。
CRISPR/CAS介导的染色体工程
强大的位点特异性核酸酶的出现，尤其是群集的定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（CAS）系统，可以进行精确的基因组操纵，已撤销了植物的育种。直到最近，研究人员的主要重点一直是简单地敲除或敲除单基因，或诱导单碱性变化，但是对这项技术的不断改进已经实现了更雄心勃勃的应用，以提高植物生产力或其他理想的特征。一个长期的目标是诱导靶向染色体重排（交叉，反转或易位）。该技术的可行性有可能改变植物繁殖，因为例如，逆转（例如反转）通常会出现繁殖过程的障碍。以这种方式，性状之间的遗传联系可以分别改变，分别结合或分开有利和有害基因。在这篇综述中，我们讨论了植物中染色体工程领域的最新突破及其在植物育种领域的潜在应用。将来，这些方法可能适用于根据植物育种需求以指示方式塑造植物染色体。